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Eficácia do Agulhamento Subcutâneo de Fu na Dor do Nervo Ciático: Alterações Comportamentais e Eletrofisiológicas em Modelo de Lesão por Constrição Crônica em Rato

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65406
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 5,6, 7,8,9
1Department of Chinese Medicine, Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital, 2Graduate Institute of Integrated Medicine, College of Chinese Medicine, China Medical University, 3Institute of Fu's Subcutaneous Needling, Beijing University of Chinese Medicine, 4Clinical Medical College of Acupuncture & Moxibustion and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine, 5Experimental Animal Center, Department of Molecular Biology and Cell Research, Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital, 6Department of Pharmacy and Master Program, Tajen University, 7Department of Physical Medicine and Rehabilitation, China Medical University Hospital, 8Department of Physical Therapy and Graduate Institute of Rehabilitation Science, China Medical University, 9Department of Physical Medicine and Rehabilitation, Asia University Hospital, Asia University
* These authors contributed equally

Summary

Apresentamos um protocolo para o uso do agulhamento subcutâneo de Fu em um modelo de lesão por constrição crônica para induzir dor no nervo ciático em ratos.

Abstract

O agulhamento subcutâneo de Fu (FSN), uma técnica de acupuntura inventada da medicina tradicional chinesa, é usado em todo o mundo para alívio da dor. No entanto, os mecanismos de ação ainda não são totalmente compreendidos. Durante o tratamento com FSN, a agulha de FSN é inserida e retida nos tecidos subcutâneos por um longo período com um movimento de oscilação. No entanto, os desafios surgem da manutenção de uma postura durante a manipulação de FSN em modelos animais (por exemplo, ratos) para pesquisadores. O tratamento desconfortável pode levar ao medo e resistência às agulhas de FSN, aumentando o risco de lesões e pode até afetar os dados da pesquisa. A anestesia também pode afetar os resultados do estudo. Assim, há necessidade de estratégias na terapia com NFL em animais que minimizem a lesão durante a intervenção. Este estudo emprega um modelo de lesão por constrição crônica em ratos Sprague-Dawley para induzir dor neuropática. Esse modelo replica a dor induzida pela lesão nervosa observada em humanos através da constrição cirúrgica de um nervo periférico, mimetizando a compressão ou aprisionamento visto em condições como síndromes de compressão nervosa e neuropatias periféricas. Introduzimos uma manipulação apropriada para inserir facilmente uma agulha FSN na camada subcutânea do corpo do animal, incluindo inserção e direção da agulha, retenção da agulha e movimento de oscilação. Minimizar o desconforto do rato evita que o rato fique tenso, o que faz com que o músculo se contraia e dificulte a entrada da agulha e melhora a eficiência do estudo.

Introduction

Estima-se que a dor neuropática, definida como dor causada por lesão nervosa, afete 6,9%-10% da população mundial, e a prevalência relatada ao longo da vida é de 49%-70%1,2. Também é considerada uma das síndromes dolorosas mais difíceis de manejar. O uso de agentes farmacológicos no tratamento da dor neuropática tem obtido sucesso limitado, uma vez que medicamentos para dor comumente prescritos, como anti-inflamatórios não hormonais e opioides, têm mostrado pouca eficácia no alívio desse tipo de dor 3,4. Há, portanto, uma grande necessidade de explorar novas opções de tratamento, especialmente tratamentos não farmacológicos. A acupuntura, como uma intervenção não farmacológica, potencialmente alivia a dor neuropática exercendo efeitos analgésicos sobre o sistema somatossensorial. Estudos clínicos e pré-clínicos indicaram que a acupuntura é eficaz no alívio dos sintomas de dor neuropática sem efeitos colaterais significativos 5,6,7. No entanto, o mecanismo central do tratamento com acupuntura para alívio da dor neuropática ainda precisa ser mais investigado.

Nos últimos anos, o agulhamento subcutâneo de Fu (NSF) ganhou popularidade no tratamento de distúrbios neurológicos relacionados à dor8. A FSN originou-se da acupuntura tradicional chinesa e foi descrita pela primeira vez pelo médico tradicional chinês Zhonghua Fu em 1996 9,10. Embora originária da acupuntura tradicional, a FSN difere significativamente em suas técnicas e teorias da acupuntura baseada em meridianos, dos princípios yin e yang e dos conceitos de pontos de acupuntura. A FSN dá maior ênfase às abordagens neurofisiológicas e anatômicas para tratar efetivamente a dor miofascial11. A terapia com FSN é aplicada na prática clínica para tratar várias desordens musculares dolorosas, visando os tecidos conjuntivos intimamente associados aos músculos, focando particularmente no tratamento de músculos contraídos (MTs)12. Como terapia complementar para o alívio da dor, também há evidências clínicas de que o NSF é efetivo no tratamento de lesões de tecidos moles, além de proporcionar rápido controle da dor e melhora significativa dos espasmos de partes moles13,14. A terapia com FSN envolve técnicas específicas adaptadas para abordar os pontos-gatilho miofasciais subjacentes (MTrPs) associados à condição. A posição de inserção da agulha FSN é cuidadosamente escolhida com base na localização desses pontos-gatilho, permitindo o direcionamento preciso das áreas afetadas. Durante o procedimento, a agulha FSN é inserida na camada subcutânea, onde é intencionalmente interrompida para otimizar os efeitos terapêuticos. Emprega-se, então, uma técnica distinta conhecida como movimento de oscilação, que envolve um suave movimento oscilante da agulha para estimular os tecidos e promover as respostas terapêuticas10. O desenvolvimento das MTrPs está associado à teoria da crise energética, que explica que fatores como sobrecarga muscular crônica, exercício excessivo, posturas inadequadas de esforço, atrofia muscular e degeneração podem contribuir para o aparecimento de isquemia e hipóxia do tecido muscular. Acredita-se que essa deficiência de oxigênio e energia no tecido muscular desempenhe um papel fundamental na formação das MTrPs15,16. Estudos prévios em animais descobriram que o tratamento com FSN para dor crônica em ratos melhora a estrutura morfológica e a função das mitocôndrias em MTs até certo ponto, validando o potencial da terapia com FSN para promover a recuperação de nervos e músculos lesados17.

A ciatalgia tem sido classificada como dor neuropática18. Acredita-se que a origem da dor neuropática esteja em qualquer lugar entre a placa motora terminal e a camada fibrosa externa do músculo, envolvendo o sistema microvascular e neurotransmissores no nível celular. A perda da inervação muscular e a apoptose das células nervosas inervadas ocorrem quando ocorre lesão nervosa19, levando à marcha relacionada à dor no membro afetado. Além disso, a compressão crônica ou irritação do nervo pode levar a uma variedade de alterações no modo de funcionamento do nervo, o que pode exacerbar ainda mais os sintomas da ciatalgia20. No entanto, a complexidade do sistema nervoso dificulta sua replicação in vitro, sendo necessária a utilização de modelos animais para tais estudos. Na investigação de distúrbios da dor neuropática, organismos modelo são comumente empregados, envolvendo vários métodos de lesão direta do nervo periférico, como ligadura do nervo ciático, transecção ou compressão21,22. O modelo de lesão por constrição crônica (ICC) em ratos Sprague-Dawley tem sido utilizado para induzir dor neuropática. Esse modelo replica a dor induzida pela lesão nervosa observada em humanos através da constrição cirúrgica de um nervo periférico, mimetizando a compressão ou aprisionamento visto em condições como síndromes de compressão nervosa e neuropatias periféricas.

Neste estudo, avaliamos os efeitos analgésicos da terapia com FSN e da eletroterapia de baixa frequência (estimulador elétrico transcutâneo de nervos, TENS) em ratos com lesão crônica por constrição e dor neuropática. Como a anestesia retarda ou bloqueia os impulsos nervosos e afeta a transmissão sináptica e a função neuronal23, os animais não podem ser anestesiados sob todos os procedimentos de agulhamento e movimentos de oscilação. Portanto, uma técnica apropriada de agulha é necessária para reduzir o desconforto em ratos. Os passos para o estabelecimento de um modelo de ICC em ratos, a maneira como os ratos foram tratados com movimento de oscilação combinado de FSN sem anestesia, testes de padrão comportamental de animais viáveis e investigações eletrofisiológicas são descritos em detalhes.

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Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital, Changhua, Taiwan (111031) em outubro de 2022 (Figura 1).

1. Preparação dos animais

  1. Compre 48 ratos machosSprague-Dawley (SD) (idade: 8-10 semanas, peso: 250-300 g).
  2. Ratos domésticos individualmente em gaiolas ventiladas a 24 ± 2 °C e um ciclo escuro e claro de 12 horas.
  3. Alimente ratos com uma dieta padrão de pellets com água potável estéril pronta para uso e forneça roupas de cama macias.

2. Agrupamento de animais

  1. Divida aleatoriamente 48 ratos SD em seis grupos (n = 8 por grupo): grupo sham, grupo ICC, grupo ICC+NSF, grupo CCI+TENS, grupo FSN isolado e grupo TENS isolado, como no estudo anterior conduzido por Chan et al.24.
    NOTA: Os detalhes de seis grupos: (1) Grupo Sham: sem cirurgia e sem tratamento; (2) Grupo ICC: preparado para cirurgia sem tratamento; (3) Grupo de tratamento CCI+FSN: tratamento com FSN após modelagem bem-sucedida de ICC; (4) Grupo de tratamento CCI+TENS: tratamento com TENS após modelagem bem-sucedida da ICC; (5) Grupo de tratamento isolado com NSF: apenas tratamento com NFL sem cirurgia; (6) Grupo tratamento TENS isolado: somente tratamento TENS sem cirurgia.

3. Estabelecimento de um modelo de CCI para ratos

NOTA: O modelo de cirurgia CCI em ratos foi modificado de acordo com Bennett e Xie realizados em 198825.

  1. Certifique-se de que o operador use máscara cirúrgica, touca cirúrgica descartável e luvas estéreis.
  2. Desinfetar a superfície da mesa cirúrgica com etanol 70%. Esterilize instrumentos (por exemplo, tesouras, pinças e afastadores), gazes, grampos e cotonetes por autoclavagem.
    NOTA: Técnicas assépticas são utilizadas durante todo o procedimento cirúrgico.
  3. Anestesiar os ratos com isoflurano a 4% após preparo padrão da pele (barbear) e manter com isoflurano a 2% (Figura 2A).
    1. Confirmar a profundidade adequada da anestesia observando a falta de resposta após pinçar a pata traseira e monitorando os ratos anestesiados durante todo o procedimento.
    2. Aplique pomada oftálmica veterinária suficiente sobre os olhos para proteção contra a secagem.
  4. Coloque o rato em decúbito ventral na mesa de cirurgia e raspe o cabelo do lado da pata traseira direita, depois desinfete a pele com solução de iodopovidona e etanol 75% três vezes. Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento e usar campos estéreis para cobrir o local cirúrgico.
    1. Faça uma incisão paralela na pele 3-4 mm abaixo do fêmur de cerca de 20-50 mm.
    2. Priorizar a identificação das posições do glúteo máximo e bíceps femoral. Separe a gordura subcutânea e a fáscia superficial camada por camada com tesoura cirúrgica, cortando o tecido conjuntivo circundante para expor o músculo (Figura 2B).
      OBS: Para distinguir as camadas de gordura subcutânea e fáscia superficial, observe a textura e a cor. A camada de gordura subcutânea deve apresentar-se macia e maleável, com aspecto amarelado ou esbranquiçado. A fáscia superficial é uma fina camada fibrosa situada diretamente abaixo da gordura subcutânea. Diferenciar entre as camadas palpando suavemente ou sondando com um instrumento rombo, observando que a gordura subcutânea oferece maior resistência à pressão em comparação com a fáscia superficial.
  5. Usando tesoura romba, corte o tecido conjuntivo entre os músculos glúteo superficial e bíceps femoral.
    1. Aumentar o espaço entre esses dois músculos usando um afastador para expor o nervo ciático (Figura 2C).
      NOTA: Para identificar visualmente o nervo ciático em um rato, concentre-se na região da coxa. Localize o ponto médio da região da coxa para visualizar o nervo ciático. Normalmente, o nervo percorre a face posterior da coxa, iniciando-se na região do quadril e estendendo-se em direção ao joelho.
    2. Sem alterar a morfologia do nervo, escolha o nervo ciático com uma microagulha através de uma boa fonte de luz. Amarrar o nervo ciático duas vezes usando ligaduras intestinais crômicas 3-0, posicionando os pontos de ligadura a aproximadamente 1 mm de distância entre as duas suturas.
    3. Começando com uma alça solta para cada ligadura, segure as extremidades da ligadura perto da alça e aperte até que a alça fique apenas aconchegante, garantindo que a ligadura não escorregue ao longo do nervo. Parar quando se observar leve contração do membro durante a ligadura (Figura 2D).
  6. Fechar o músculo e a pele camada por camada com linhas de sutura 4-0. Por fim, desinfetar a ferida com iodo (Figura 2E).
  7. Monitorar de perto os sinais vitais dos ratos durante a anestesia e colocá-los em gaiolas de recuperação individuais até que estejam acordados antes de colocá-los de volta em suas gaiolas. Forre as gaiolas com roupa de cama de papel liso para evitar asfixia em animais inconscientes. Uma breve contração no membro pós-operatório indica uma operação bem-sucedida (Figura 2F).
  8. Realizar teste de hipersensibilidade à dor várias vezes antes da ICC (basal) e em diferentes momentos após a ICC.
  9. Observar dor espontânea e mudanças comportamentais nos dias 1, 3, 5 e 7 após a construção do modelo.
    OBS: Observar a marcha e postura do membro posterior direito e a presença de lambeduras e mordidas no membro.
    1. Identificar a presença de dor neuropática para determinar o estabelecimento bem-sucedido do modelo e excluir ratos malsucedidos.
      NOTA: Avalie o sucesso do modelo observando sinais como fraqueza na marcha dos membros inferiores, dedos do membro direito unidos com valgo leve, penduricalhos frequentes e relutância em aterrissar. Observe o rato em pé com o membro posterior esquerdo suportando o peso, enquanto o membro posterior direito está elevado e próximo ao abdome.

4. Administração da manipulação do FSN

  1. Fixar o rato do grupo de tratamento com FSN (incluindo o grupo CCI+FSN e FSN isolado) na contenção do roedor com o membro afetado exposto lateralmente. Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento. Ambos os grupos foram tratados com agulhas descartáveis FSN (Figura 3A).
  2. Sem anestesia, estender os membros pélvicos do rato de forma gradual e lenta até que sejam esticados com força (Figura 3B).
    NOTA: A cabeça do rato é coberta com um pano cirúrgico para manter o animal calmo e estável. Não estenda demais a perna para causar lesões no rato. Observe atentamente a resposta do rato para quaisquer sinais de angústia ou desconforto. Se o rato mostrar sinais de dor ou desconforto, pare a extensão e providencie uma pausa antes de tentar novamente.
  3. Remova a bainha protetora da agulha FSN.
    1. Inserir a ponta da agulha FSN em direção às MTs (músculos com MTrPs), aproximadamente próxima ao músculo glúteo máximo, localizado na parte inferior das costas e atrás.
  4. Coloque a agulha FSN plana e entre na pele em um ângulo de aproximadamente 15°.
    1. Empurre-o com cuidado e rapidamente através da pele e para o espaço subcutâneo para evitar o estresse no rato até que esteja totalmente inserido. Certifique-se de que a agulha está inserida o suficiente para enterrar completamente o tubo macio sob a pele.
    2. Ao empurrar para frente, levante levemente a ponta da agulha para observar se a protuberância da pele se move ao longo da ponta da agulha (Figura 3C).
  5. Execute o movimento de oscilação agitando suave e suavemente a ponta da agulha FSN com o polegar como ponto de apoio, mantendo o dedo indicador, o dedo médio e o dedo anelar alinhados em linha reta.
    1. Segure a agulha FSN entre o dedo médio e o polegar em uma posição face a face e alterne o movimento para frente e para trás usando os dedos indicador e anular.
    2. Ajuste a frequência para 100 golpes por minuto e execute a operação por aproximadamente 1 min (Figura 3D).
  6. Após completar a manipulação, retirar rapidamente a agulha FSN.
    OBS: A operação foi realizada a cada 2 dias, totalizando quatro sessões (dias 1, 3, 5 e 7 após a criação do modelo ICC). As agulhas descartáveis FSN devem ser usadas uma vez. O uso repetido embotará a agulha e causará aumento da dor em ratos.

5. Administração da manipulação da TENS

  1. Fixar o rato do grupo de tratamento com TENS (incluindo o grupo CCI+TENS e TENS isoladamente) na contenção do roedor com o membro afetado exposto lateralmente. Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento. Certifique-se de que o pelo é raspado antes de ser tratado.
    OBS: Os eletrodos foram cortados em 45 mm (comprimento) por 5 mm (largura) (Figura 4A).
  2. Escolha o ponto Zusanli (ST36) e o ponto Sanyinjiao (SP6) como os locais para TENS. Isso se baseia na teoria para o tratamento da dor neuropática26,27.
    1. Localizar o ponto de Zusanli (ST36) aproximadamente 5 mm lateral ao tubérculo anterior da tíbia entre a tíbia e a fíbula logo abaixo do joelho28.
    2. Localizar o ponto de Sanyinjiao (SP6) na borda posterior da tíbia, 3 mm proximal ao maléolomedial28.
      OBS: Ambos os pontos de acupuntura estão localizados por inspeção manual conforme descrito por Stux e Pomeranz e no atlas de acupuntura animal28,29 (Figura 4B).
  3. Realizar uma estimulação elétrica de baixa frequência (onda senoidal contínua de 2 Hz, 3 mA) por 10 min usando o dispositivo TENS com o eletrodo aplicado na perna ao redor do nervo. Cubra a cabeça do rato com um pano cirúrgico para mantê-lo calmo e estável.
    NOTA: Este procedimento é realizado a cada 2 dias para um total de quatro sessões (dias 1, 3, 5 e 7 após a criação do modelo CCI).

6. Medidas fisiológicas realizando o teste comportamental animal

NOTA: O índice de função ciática (IFC)30 é um índice amplamente utilizado por pesquisadores que estudam patologia e potencial tratamento de lesões nervosas, determinado comparando-se a geometria da pata traseira afetada em ratos lesados com a da pata contralateral e comparando-a com a pata oposta.

  1. Projete passarelas de ratos com plexiglass transparente e espelhos inclinados para capturar as pegadas e a orientação corporal dos ratos durante a caminhada.
    NOTA: A passarela é uma plataforma de 10 cm de comprimento, 50 cm de largura e 15 cm de altura com um forro de papel branco na parte inferior (Figura 5A).
  2. Coloque suave e livremente os ratos na caixa e deixe-os se aclimatarem ao novo ambiente por pelo menos 5 minutos antes da gravação.
    OBS: Cuidados especiais são tomados para minimizar o estresse desnecessário no animal para evitar seu possível efeito sobre a tensão muscular postural.
  3. Mergulhe as patas do rato em tinta vermelha e permita que o rato caminhe ao longo da faixa da passarela, deixando vestígios no papel de apoio. Registrar pelo menos 2 s de caminhada contínua para cada teste. Fazer o rato caminhar pelo menos 3 vezes em uma direção (Figura 5B).
    NOTA: Aplique tinta vermelha de secagem rápida, atóxica e solúvel em água em ambas as patas traseiras para tornar as pegadas traseiras claramente visíveis.
  4. Ao final do experimento, secar as faixas da passarela para medir os parâmetros. Meça suas pegadas com uma régua e arredondar com precisão de 0,5 mm.
    NOTA: Três pegadas claras de cada rato foram selecionadas a partir de várias pegadas, e três parâmetros diferentes foram medidos. Os fatores para o SFI incluem comprimento de impressão (PL), distância do dedo do pé (TS) e spread intermediário do dedo do pé (ITS).
    Os valores do IFC são calculados utilizando a seguinte fórmula31:
    Equation 1
    (EPL, comprimento de impressão experimental; NPL, comprimento de impressão normal; AET, difusão experimental dos dedos; NTS, disseminação normal dos dedos dos pés; TIE, difusão experimental intermediária dos dedos; NIT, espalhamento intermediário do dedo do pé.)
    O IFC = 0 e - 100 indica disfunção normal e completa. Aos ratos que arrastavam os dedos dos pés foi arbitrariamente atribuído um valor de -100. Para a função neurológica normal, o IFC oscila em torno de 0, enquanto em torno de -100 o IFC representa disfunção completa32.

7. Avaliação neurofisiológica por medida eletrofisiológica33

OBS: A eletromiografia foi utilizada para registrar a atividade eletrofisiológica neste estudo. O potencial de ação muscular composto (PAMC) é causado pela ativação de fibras musculares no músculo alvo suprido pelo nervo. A amplitude e a latência do CMAP são investigadas. A amplitude do CMAP é medida desde o início até o pico negativo. A latência dos PAMC é determinada pela medida do tempo entre a aplicação do estímulo e o início do potencial de ação composto, que é influenciado pela distância entre o local de estimulação e o local de registro. A eletrofisiologia fornece uma avaliação objetiva da função nervosa periférica em ratos.

  1. Administrar Zoletil 50 (40 mg/kg, ip) para anestesiar os ratos. Preparar a pele de acordo com os protocolos padrão (barbear).
  2. Coloque eletrodos de superfície adesivos descartáveis (20 mm de diâmetro externo) nas áreas designadas. Fixar os eletrodos de registro nas superfícies lateral e dorsal do músculo gastrocnêmio (Figura 6A).
  3. Aplicar estimulação elétrica (intensidade 1,2 mA) na haste proximal do nervo ciático direito. Registrar um potencial de ação muscular composto (PAMC) no ventre do músculo gastrocnêmio (Figura 6B).
    NOTA: Tenha cuidado ao inserir os eletrodos para evitar o tecido muscular.
  4. Registrar o efeito de três medidas repetidas para cada rato.
    NOTA: O CAMP é expresso como a média ± DP de cada grupo. O sinal foi amplificado por um amplificador, filtrado (0,3-3 kHz). Após a integração (constante de tempo = 0,05 s), tanto o sinal original quanto o sinal integrado são inseridos. O sinal original e o sinal integrado são então digitalizados no sistema PowerLab e armazenados no disco rígido do computador.
  5. Após completar os procedimentos eletrofisiológicos, mova o rato para uma gaiola diferente e monitore-o até que ele recupere a consciência suficiente para manter uma posição esternal reclinada. Uma vez que o rato tenha se recuperado totalmente do anestésico, transfira-o de volta para sua gaiola original.

8. Estatísticas:

  1. Avaliar diferenças no IFC e CMAPs entre os grupos usando análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas.
  2. Quantificar os dados por assistentes cegos para as condições experimentais. Expresse os dados como média ± desvio padrão.
  3. Comparar os dados, quando apropriado, usando o teste t bicaudal pareado e não pareado de Student. Estabelecer significância estatística como p < 0,05.

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Representative Results

Pegadas e determinação do SFI
Examinamos o desenvolvimento do IFC nos grupos ICC isoladamente, ICC+FSN e CCI+TENS (Figura 7). Após 4 sessões de tratamentos com FSN e TENS no dia 7 para cirurgia de ICC, o IFC nos grupos ICC+FSN (-15,85 ± 3,46) e CCI+TENS (-29,58 ± 9,19) melhorou significativamente em comparação com o grupo CCI isolado (-87,40 ± 14,22). A melhora foi significativa no grupo ICC+NSF em relação ao grupo ICC+TENS (Figura 7A).

Também investigamos o IFC nos grupos sham (0,02 ± 0,52), FSN isolado (0,06 ± 1,75) e TENS isolado (-2,36 ± 1,22). Os resultados mostraram que nenhum desses dois últimos grupos e o grupo sham apresentaram diferença significativa entre si (Figura 7B). Isso indica que o FSN e a TENS são tratamentos seguros que não causam danos aos ratos em seu estado saudável (Tabela 1).

Resposta eletrofisiológica
Examinamos o desenvolvimento da amplitude do CMAP nos grupos de tratamento CCI isolado, CCI+FSN e CCI+TENS (Figura 8). A amplitude do CMAP nos grupos ICC+FSN (5,01 mV ± 0,67 mV) e CCI+TENS (4,64 mV ± 1,96 mV) melhorou significativamente em comparação com o grupo CCI isolado (1,80 mV ± 0,34 mV) (Tabela 2). Os grupos ICC+NSF e ICC+TENS não apresentaram diferença significativa (Figura 8A).

Também examinamos o desenvolvimento dos picos de latência do CMAP nos grupos ICC isoladamente, CCI+FSN e CCI+TENS. Os picos de latência do CMAP nos grupos ICC+FSN (2,46 ms ± 0,72 ms) e ICC+TENS (2,26 ms ± 0,97 ms) melhoraram significativamente em relação ao grupo CCI isolado (1,23 ms ± 0,22 ms) (Tabela 3). Os grupos ICC+NSF e ICC+TENS não apresentaram diferença significativa (Figura 8C).

A amplitude e a latência do CMAP foram pesquisadas nos grupos sham (5,80 mV ±0,53 mV; 2,35 ms ± 0,37 ms), FSN isoladamente (5,70 mV ± 0,45 mV; 2,64 ms ± 0,41 ms) e TENS isoladamente (5,54 mV ± 0,92 mV; 2,61 ms ± 0,20 ms), não sendo observada diferença significativa entre nenhum deles. Isso indica que FSN e TENS são tratamentos seguros e não causam danos aos ratos em seu estado saudável (Figura 8B,D).

Figure 1
Figura 1: Visão esquemática da linha do tempo para estabelecer o modelo de ratos CCI. Os limiares de dor são medidos a partir do primeiro dia após a modelagem (-7 dias) e, posteriormente, a cada 2 dias (-5, -3, -1 dias). Os limiares de dor medidos no dia 1 indicam o sucesso da modelagem. Após a modelagem, a intervenção e as medidas eletrofisiológicas são iniciadas no dia 1. Os grupos CCI+FSN, CCI+TENS, FSN isoladamente e TENS isoladamente foram tratados com FSN ou TENS em momentos fixos nos dias 1, 3, 5 e 7, respectivamente. Os ratos foram sacrificados no 7º dia após as medidas eletrofisiológicas e fisiológicas. Abreviações: FSN: agulhamento subcutâneo de Fu; TENS: estimulação elétrica nervosa transcutânea; ICC: lesão por constrição crônica; IFC: índice de função ciática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Lesão por constrição crônica (ICC) por induzir dor neuropática do nervo ciático de ratos. (A) Após o posicionamento e desinfecção, a pata traseira direita do rato é raspada. Uma incisão paralela é feita na pele 3-4 mm acima do fêmur. (B) O local é inserido cuidadosamente enquanto se coa o músculo, separando-as as fibras musculares e, em seguida, retirando-as em camadas sem fechá-las completamente. O tecido conjuntivo entre os músculos glúteo superficial e bíceps femoral é incisado e a fáscia é separada camada por camada. (C) A incisão permanece aberta, expondo o nervo ciático lateral direito. (D) A ligadura é amarrada ao redor do nervo ciático usando uma sutura de cromo 3-0, garantindo que a ligadura seja fixada no lugar e não deslize ao longo do nervo e restrinja o fluxo sanguíneo para a membrana externa do nervo. (E) A camada muscular e a pele são fechadas com suturas. (F) Uma breve contração no membro pós-operatório (Os círculos vermelhos indicam o ramo terminal do nervo ciático) indica uma operação bem-sucedida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Manipulação do agulhamento subcutâneo de Fu (NSF). (A) Fixar o rato na contenção do roedor com os membros posteriores expostos, evitando esforço (B) A agulha FSN é inserida em direção ao músculo contraído, aproximadamente próximo ao músculo glúteo máximo. (C) A agulha é inserida na pele com a ponta da agulha colocada a aproximadamente 15° da pele. (D) Movimento de oscilação (ventilador preto) do agulhamento subcutâneo Fu. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Posição e fixação dos eletrodos na superfície da pele do rato para aplicação da estimulação elétrica nervosa transcutânea (TENS). (A) Eletrodos, cortados a 45 mm (comprimento) por 5 mm (largura), colocados no rato. (B) Localização dos acupontos ST 36 e SP6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Registro das pegadas na passarela. (A) A passarela para medidas fisiológicas pela avaliação do índice funcional do ciático (IFC). (B) Impressão das pegadas registradas no7º dia de pós-operatório. Diferenças em várias medidas de patas de animais podem diferenciar entre as patas dos grupos sham, CCI, CCI+FSN, CCI+TENS, FSN sozinho e TENS sozinho. Medidas como interdedos (TI, a distância transversal entre o segundo dedo e o quarto dedo), a dispersão dos dedos (TS, a distância transversal entre o primeiro e o quinto dedo) e o comprimento da pata (PL) são usadas para calcular valores como o IFC. Abreviações: FSN: agulhamento subcutâneo de Fu; TENS: estimulação elétrica nervosa transcutânea; ICC: lesão por constrição crônica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Variação da atividade nervosa digital em função da intensidade do estímulo e das medidas do local de registro distal de ratos via eletrofisiologia. (A) Medidas eletrofisiológicas para registro dos potenciais compostos de ação muscular (PAMC). Os eletrodos de registro e referência (adesivo azul) são colocados nos músculos gastrocnêmio lateral e medial, respectivamente, e a estimulação elétrica é aplicada na extremidade proximal do tronco do nervo ciático direito sob anestesia induzida e mantida com Zoletil. (B) Rastreamentos representativos de CMAPs sham, CCI, CCI+FSN, CCI+TENS, FSN isoladamente e TENS isoladamente após 4 tratamentos (antes da eutanásia do animal). Para calcular as amplitudes do potencial de ação muscular composto (PAMC) basal-a-pico (B-P) e pico-a-pico (P-P), a forma de onda é medida da linha de base (I) para o pico negativo (II) e do pico negativo (II) para o pico positivo (III), respectivamente. O eixo X representa o tempo (ms) e o eixo Y representa a tensão (mV). Sensibilidade: 1 mV; Duração: 2 ms, 1 ms por quadro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Índice funcional do ciático (IFC) para cada grupo. (A) Comparação do IFC entre os grupos ICC, ICC+FSN e ICC+TENS (* p < 0,05). (B) Comparação do IFC entre os grupos sham, FSN isolado e TENS isolado. Abreviações: FSN: agulhamento subcutâneo de Fu; TENS: estimulação elétrica nervosa transcutânea; ICC: lesão por constrição crônica; IFC: índice de função ciática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Achados eletrofisiológicos de cada grupo. (A) Amplitude da PAMC, comparação entre os grupos ICC, ICC+FSN e CCI+TENS (* p < 0,05). (B) Amplitude da PAMC, comparação entre os grupos Sham, FSN isolado e TENS isolado. (C) Picos de latência da PAMC, comparação entre os grupos ICC, ICC+FSN e CCI+TENS (* p < 0,05). (D) Picos de latência da PAMC, comparação entre os grupos Sham, FSN isolado e TENS isolado. Abreviações: FSN: agulhamento subcutâneo de Fu; TENS: estimulação elétrica nervosa transcutânea; ICC: lesão por constrição crônica; PAMC: potencial de ação muscular composto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

N Significar SD
Farsa 8 0.02 0.52
CCI 8 -87.40 14.22
CCI+FSN 8 -15.85 3.46
CCI+DEZ 8 -29.58 9.19
FSN 8 0.06 1.75
DEZ 8 -2.36 1.22
FSN: agulhamento subcutâneo de Fu;
TENS: estimulação elétrica nervosa transcutânea;
ICC: lesão por constrição crônica.

Tabela 1: Resumo dos valores do índice funcional do ciático em ratos.

N Média (mV) SD
Farsa 8 5.80 0.53
CCI 8 1.80 0.34
CCI+FSN 8 5.01 0.67
CCI+DEZ 8 4.64 1.96
FSN 8 5.70 0.45
DEZ 8 5.54 0.92
FSN: agulhamento subcutâneo de Fu;
TENS: estimulação elétrica nervosa transcutânea;
ICC: lesão por constrição crônica;
PAMC: potencial de ação muscular composto.

Tabela 2: Resumo dos valores da resposta eletrofisiológica na amplitude do CMAP em ratos.

N Média (ms) SD
Farsa 8 2.35 0.37
CCI 8 1.23 0.22
CCI+FSN 8 2.46 0.72
CCI+DEZ 8 2.26 0.97
FSN 8 2.64 0.41
DEZ 8 2.61 0.20
FSN: agulhamento subcutâneo de Fu;
TENS: estimulação elétrica nervosa transcutânea;
ICC: lesão por constrição crônica.

Tabela 3: Resumo dos valores da resposta eletrofisiológica nos picos de latência em ratos.

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Discussion

Este estudo observa o efeito do tratamento com FSN na dor neuropática em modelos de ICC de ratos. Este estudo apresenta um protocolo de IFC e testes eletrofisiológicos para avaliar os efeitos terapêuticos após o tratamento com NSF ou TENS. Além disso, ilustra como avaliar a recuperação funcional do nervo lesado por meio de testes comportamentais não invasivos e medidas fisiológicas. Os resultados mostraram que o tratamento com NSF após dor no nervo ciático induzida por ICC apresentou melhora significativamente melhor em todos os indicadores prognósticos do que o tratamento com TENS. Esta pesquisa tem grande potencial para futuras aplicações em estudos com animais focados na terapia com FSN para preencher a lacuna entre a pesquisa básica e a aplicação clínica. Este estudo melhorará os resultados dos pacientes por meio de uma melhor compreensão dos mecanismos da doença

A acupuntura é utilizada na China há mais de 3000 anos e é frequentemente considerada um método seguro e eficaz para o alívio da dor em humanos e animais de experimentação34,35. Estudos clínicos prévios confirmaram que a acupuntura poderia aliviar o comportamento da dor em modelos de ICC36. A FSN, como uma técnica de acupuntura desenvolvida a partir da acupuntura tradicional chinesa37, é amplamente utilizada no tratamento de muitas desordens musculoesqueléticas relacionadas à dor38,39. Apesar de sua eficácia satisfatória em distúrbios musculoesqueléticos dolorosos, o mecanismo subjacente do tratamento com FSN permanece obscuro. As dificuldades de realização de experimentos de acupuntura em animais, incluindo a complexidade e dificuldade de quantificar as técnicas tradicionais de acupuntura e a postura desconfortável do animal, podem levar ao medo e resistência à acupuntura, dificultando a técnica adequada de acupuntura e o posicionamento dos pontos, aumentando o risco de lesões e afetando os dados experimentais40. Pesquisas recentes em estudos com animais têm lançado luz sobre os mecanismos subjacentes à analgesia por acupuntura; A analgesia induzida pela acupuntura está associada à liberação de peptídeos opioides endógenos41. No entanto, a percepção da dor não é modulada apenas durante a transmissão dos sinais de dor da periferia para o córtex, indicando que outros fatores e mecanismos também podem influenciar a experiência da dor.

Com base na hipótese apresentada por Simons et al.42,43, a formação de MTrP desempenha um papel fundamental na sensação de dor. Acredita-se que a patogênese da formação do ponto de gatilho esteja relacionada à placa terminal motora anormal dentro do músculo. A liberação excessiva de acetilcolina leva a potenciais de placa terminal anormais e formação de bandagens, que podem levar a espasmos musculares persistentes, resultando em isquemia e hipóxia locais, levando a hiperalgesia e dor anormal44,45. Um modelo animal para o estudo da MTrP em coelhos utilizando agulhas secas estabelecido por Hong46 demonstra que o agulhamento seco pode modular a MTrPs proximal no músculo e na medula espinhal. No entanto, apenas a relação entre acupuntura e músculo foi discutida neste experimento, e menos experimentos em animais foram realizados em relação à lesão nervosa. FSN não é o mesmo que acupuntura tradicional ou agulhamento seco em termos de técnica e base teórica. O tratamento com NSF não atua diretamente no nervo lesado, mas é clinicamente eficaz47,48. Foi demonstrado que, em muitas doenças neurológicas clínicas, o principal problema pode estar no músculo e não no nervo em si. Neste estudo, ao incorporar um modelo de lesão nervosa com ICC e tratar os músculos ao redor do nervo ciático com FSN, a terapia com FSN mostrou uma redução significativa da dor neuropática e promoveu a recuperação do nervo e músculo lesados.

Um foco adicional deste experimento são os benefícios do tratamento com FSN sem anestesia. Um estudo anterior mostrou que a realização de experimentos de acupuntura em ratos sem anestesia pode alterar parâmetros fisiológicos como frequência cardíaca, pressão arterial e níveis hormonais devido ao estresse de imobilização49. No entanto, alguns pesquisadores têm argumentado que os benefícios da realização de experimentos de acupuntura sem anestesia superam os efeitos potenciais do estresse de imobilização, até mesmo neutralizam os efeitos do estresse de imobilização50. Devido ao pequeno tamanho dos roedores e sua sensibilidade diferencial a anestésicos e analgésicos, além da perda de consciência causada pela anestesia geral, os animais não conseguem perceber a dor. No entanto, em animais inconscientes, os estímulos dolorosos ainda são transmitidos e processados através do sistema nervoso central51. Além do pequeno porte dos animais roedores e de sua sensibilidade diferencial a anestésicos e analgésicos, em animais inconscientes, os estímulos dolorosos ainda são transmitidos e processados pelo sistema nervoso central. O uso de antagonistas dos receptores μ e δ-opioides em animais tratados sob anestesia pode, inclusive, causar reversão da eficácia da acupuntura40,52.

Selecionamos a TENS como grupo controle para este estudo. A TENS é um tratamento analgésico que utiliza correntes elétricas pulsadas de baixa frequência transmitidas através da pele através de eletrodos, sem o uso de medicação53. Observou-se que a TENS de baixa frequência foi mais efetiva que a de alta frequência no aumento da resposta vascular e pode ser um potencial tratamento para a dor neuropática causada pelo ICC54. A acupuntura é eficaz para condições que incluem dor neuropática. No entanto, os resultados podem variar consideravelmente dependendo do ponto de acupuntura escolhido55, enquanto a TENS reduz a hipersensibilidade nociceptiva por ativar vias inibitórias centrais com baixa variabilidade na seleção de diferentes locais56.

Embora os resultados deste estudo sejam animadores, algumas limitações do estudo devem ser observadas. De acordo com a orientação do Dr. Fu, um método completo de tratamento com FSN deve incluir o movimento de oscilação (tratamento passivo) e a técnica de reperfusão (tratamento ativo). No entanto, este experimento tem apenas um movimento de oscilação; É necessário projetar um melhor experimento animal no futuro. Estudos padronizados prévios estabeleceram que a avaliação de modelos animais de compressão nervosa requer a integração de múltiplos indicadores, incluindo análise comportamental, eletromiografia, imunohistoquímica e avaliação morfológica57. Em nosso estudo, usamos principalmente análise comportamental e eletromiografia para avaliar a eficácia da terapia com NFL. No entanto, devido à potencial importância da avaliação imunoistoquímica e morfológica nesse contexto, reconhecemos a necessidade de priorizar esses componentes em futuros estudos de seguimento para melhor validar a eficácia da terapia com NSF na melhora desse tipo de doença.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse concorrentes.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado por uma concessão do centro animal do Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital, Changhua, Taiwan. Os autores gostariam de agradecer ao Show Chwan Memorial Hospital IRCAD TAIWAN por seu inestimável apoio e assistência ao longo deste projeto de pesquisa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps World Precision Instruments 14098
Fu’s subcutaneous needling Nanjing Paifu Medical Science and Technology Co.  FSN needles are designed for single use. The FSN needle is made up of three parts: a solid steel needle core (bottom), a soft casing pipe (middle), and a protecting sheath (top).
Medelec Synergy electromyography Oxford Instrument Medical Ltd. 034W003  Electromyogram (EMG) are used to help in the diagnosis and management of disorders such as neuropathies. Contains a portable two-channel electromyography/nerve conduction velocity system.
Normal saline (0.9%) 20 mL Taiwan Biotech Co.,Ltd. 4711916010323 Lot: 1TKB2022
POLYSORB 4-0 VIOLET 30" CV-25 UNITED STATES SURGICAL, A DIVISION OF TYCO HEALTHC GL-181
Retractor COOPERSURGICAL, INC.(USA) 3311-8G
Rompun Elanco Animal Health Korea Co. Ltd. 27668
SCISSORS CVD 90MM BBRUAN XG-LBB-BC101R
Transcutaneous Electrical Nerve Stimulation Well-Life Healthcare Co. Model Number 2205A Digital unit which offers TENS. Supplied complete with patient leads, self-adhesive electrodes, 3 AAA batteries and instructions in a soft carry bag. Interval ON time 1–30 s. Interval OFF time 1–30 s.
Zoletil  VIRRBAC 8V8HA

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Eficácia do Agulhamento Subcutâneo de Fu na Dor do Nervo Ciático: Alterações Comportamentais e Eletrofisiológicas em Modelo de Lesão por Constrição Crônica em Rato
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