Summary
Denne protokol beskriver omprogrammeringen af Pancreas Ductal Adenocarcinom (PDAC) og normale pancreas ductal epitelceller til inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er). Vi leverer en optimeret og detaljeret, trin-for-trin procedure, fra forberedelse af lentivirus til etablering af stabile iPSC-linjer.
Abstract
Genereringen af inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) ved hjælp af transkriptionsfaktorer er opnået fra næsten enhver differentieret celletype og har vist sig at være yderst værdifuld til forskning og kliniske anvendelser. Interessant nok har iPSC-omprogrammering af kræftceller, såsom pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), vist sig at vende tilbage til den invasive PDAC-fænotype og tilsidesætte kræftepigenomet. Differentieringen af PDAC-afledte iPSC'er kan rekapitulere PDAC-progression fra dens tidlige pancreas intraepitelial neoplasi (PanIN) forløber, hvilket afslører de molekylære og cellulære ændringer, der opstår tidligt under PDAC-progression. Derfor kan PDAC-afledte iPSC'er bruges til at modellere de tidligste stadier af PDAC til opdagelse af diagnostiske markører til tidlig detektion. Dette er især vigtigt for PDAC-patienter, som typisk diagnosticeres i de sene metastatiske stadier på grund af mangel på pålidelige biomarkører for de tidligere PanIN-stadier. Omprogrammering af kræftcellelinjer, herunder PDAC, til pluripotens forbliver imidlertid udfordrende, arbejdskrævende og meget variabel mellem forskellige linjer. Her beskriver vi en mere konsistent protokol til generering af iPSC'er fra forskellige humane PDAC-cellelinjer ved hjælp af bicistroniske lentivirale vektorer. De resulterende iPSC-linjer er stabile og viser ingen afhængighed af den eksogene ekspression af omprogrammeringsfaktorer eller inducerbare lægemidler. Samlet set letter denne protokol genereringen af en bred vifte af PDAC-afledte iPSC'er, hvilket er afgørende for at opdage tidlige biomarkører, der er mere specifikke og repræsentative for PDAC-tilfælde.
Introduction
Pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) er en af de mest dødelige maligniteter, og tidlig diagnose forbliver udfordrende på grund af sygdommens asymptomatiske karakter. Størstedelen af PDAC-patienter diagnosticeres på det avancerede metastatiske stadium, når meget begrænsede behandlingsmuligheder er tilgængelige 1,2. Dette skyldes hovedsageligt manglen på pålidelige biomarkører for de tidligere stadier, såsom dem, der bekvemt kunne detekteres som proteiner frigivet i blodbanen.
PDAC kan sprede sig meget tidligt i sin progression, og en bedre prognose har været forbundet med tidlig kræftdetektion, når PDAC er lokaliseret i bugspytkirtlen3. Imidlertid diagnosticeres mindre end en tiendedel af PDAC-patienter med en gunstig prognose, hvilket giver mulighed for kirurgisk resektion. Ikke desto mindre er de få med resekterbare tumorer også tilbøjelige til tumorgentagelse inden for 12 måneder4.
I de sidste fem årtier er der foretaget bemærkelsesværdige forbedringer i kirurgiske teknikker, patientpleje og behandlingsmetoder 5,6. Imidlertid er den 5-årige overlevelsesrate hos kirurgisk resekterede PDAC-patienter næppe steget til 17%. Ikke desto mindre er dette stadig bedre end hos ikke-resekterede patienter, som er forblevet næsten uændret (0,9%)4,7. Kemoterapi er den eneste anden alternative PDAC-behandling. Alligevel er denne mulighed meget begrænset, da det store flertal af PDAC-patienter udviser stærk resistens over for kemoterapimedicin såsom Gemcitabin 7,8. Andre lægemidler, såsom Erlotinib, er kun tilgængelige for en lille gruppe PDAC-patienter med specifikke mutationer, hvoraf de fleste viser Erlotinib-resistens9. De negative bivirkninger forbundet med kemoterapi hos de fleste PDAC-patienter er endnu en ulempe ved denne behandling10. For nylig har lovende strategier vist, at immuncheckpointhæmmere (ICI'er) og små molekylekinasehæmmere (SMKI'er) kan være effektive til behandling af PDAC, men varige reaktioner på disse målrettede terapier forbliver begrænset til et mindretal af patienter11,12. Samlet set kan opdagelsen af PDAC-specifikke tidlige biomarkører bane nye veje for tidlig diagnose og behandling.
PDAC udvikler sig fra pancreas intraepitelial neoplasmer (PanIN) forløber læsioner, der skyldes ikke-invasive pancreas kanal epitelproliferationer13,14. Mens dannelsen af PanIN initieres af onkogenmutationer såsom KRAS, kræves yderligere genetiske og epigenetiske ændringer for progressionen til PDAC. Det er blevet projiceret, at progressionen af PanIN gennem de forskellige stadier til invasiv PDAC tager omkring10 år 13,15,16,17. Denne tidsramme giver en fantastisk mulighed for at drage fordel af tidlig PDAC-diagnose. Derfor er der udført omfattende forskning for at etablere tumorxenograft dyremodeller og organoidkulturer for at studere PDAC-progression 18,19,20,21. Disse modeller har været meget nyttige til at studere de invasive stadier af PDAC, men ikke overgangen fra de tidlige PanIN-faser. Det er derfor vigtigt at udvikle eksperimentelle modeller, der kan rekapitulere den tidlige progression af PanIN-stadier for at muliggøre opdagelsen af biomarkører for tidlig detektion.
Omprogrammering af somatiske celler til inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) ved hjælp af de fire transkriptionsfaktorer OCT4, SOX2, KLF4 og c-MYC (OSKM) har illustreret omfanget af cellulær plasticitet22. Kræftcelleplasticitet er veldokumenteret, og omprogrammering af humane kræftceller til iPSC'er er med succes blevet brugt til at nulstille celler til deres oprindelige cellulære tilstand, hvilket fjerner mange af de epigenetiske fornærmelser, der er akkumuleret under kræftprogression 23,24,25,26,27,28,29. Muligheden for at bruge denne omprogrammeringsstrategi til at manipulere kræftcelleidentitet har derfor været meget lovende i behandlingen af kræft 30,31. Faktisk har vi tidligere vist, at differentieringen af iPSC'er afledt af PDAC'er kan rekapitulere PDAC-progression gennem de tidlige PanIN-stadier32. Ved at identificere gener og veje, der er specifikke for de tidlige til mellemliggende stadier af PDAC, blev kandidatbiomarkører identificeret, der klinisk kan anvendes til tidlig PDAC-diagnose32,33. Biomarkørerne opdaget ved hjælp af en enkelt iPSC-linje viste imidlertid begrænset dækning hos størstedelen af PDAC-patienter32. Udfordringerne med at generere iPSC-linjer fra andre PDAC-patienter har stoppet evnen til at opdage mere pålidelige biomarkører. Dette skyldes mange tekniske faktorer, herunder heterogeniteten af OSKM-levering, da kun en lille del af humane primære PDAC-celler indeholdt alle fire faktorer og reagerede med succes på omprogrammering. Her præsenteres en detaljeret protokol til omprogrammering af primære PDAC-celler ved hjælp af en mere effektiv og konsistent dobbelt lentiviral levering af OSKM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af OHSU Institutional Review Board. Alle metoder blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler. Alle dyrearbejder for PDX-tumorer blev udført med godkendelse fra OHSU Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC). Denne protokol blev testet i primære PDAC-celler fra patientafledt xenograft (PDX), BxPc3-cellelinje, der udviser epitelmorfologi, der blev isoleret fra bugspytkirtelvævet hos en 61-årig kvindelig patient med adenokarcinom, H6C7 udødeliggjort epitelcellelinje afledt af normal human bugspytkirtelkanalepitel og primære humane fibroblaster afledt af hudbiopsi hos raske individer. Humane PDAC-prøver blev opnået under Oregon Pancreas Tissue Registry -undersøgelsen (IRB00003609). Der blev indhentet informeret samtykke fra alle forsøgspersoner. Humane primære fibroblaster blev afledt i RBiomedical, Edinburgh, Storbritannien, fra hudprøver fra anonyme donorer, der gennemgik rutinemæssig kirurgi på Edinburgh Royal Infirmary, Little France, UK, under deres samtykke og etiske godkendelse (09/MRE00/91). Alt lentivirusarbejde er udført under klasse 2-forskningsaktivitet (GM207/16.6) og godkendt af sundheds- og sikkerhedsafdelingen ved University of Edinburgh og anmeldt til HSE's kompetente myndighed i den skotske regering. Alle omprogrammeringseksperimenter ved hjælp af humane bugspytkirtelceller blev udført under etisk godkendelse af School of Biological Sciences etiske udvalg ved University of Edinburgh (reference # asoufi-0002).
1. Fremstilling af lentivirus
- Til lentiviruspræparation fremstilles emballage- og ekspressionsplasmider af høj kvalitet (endotoksinfri) med koncentrationer mellem 1-2 μg/μL inklusive psPAX2, pMDG34 og to RES-holdige bicistronvektorer. pSIN4-EF1a-O2S-kodningen for OCT4- og SOX2-ekspression drevet af EF-1α-promotor og pSIN4-CMV-K2M for KLF4- og c-MYC-ekspression under CMV-forstærkeren/promotoren35 (se materialetabel). Forbered også pWPT-GFP-plasmid, der skal bruges som transfektionskontrol.
- Optø Human Embryonic Kidney cellelinje (293T) og kultur i Glasgows Minimum Essential Medium (GMEM), suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 1x ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat og 1 mM glutamin ved (se materialetabel) 37 °C og 5% CO2.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge 293T-celler inden for fire passager efter optøning. - Frø 293T ved en tæthed på 3 millioner celler pr. 15 cm skål, 24 timer før transfektion. Der kræves i alt tre retter. Det foretrækkes frem for frøceller senere på eftermiddagen ~ 16:00.
- Næste dag (~ 16:00), når celler når ~ 40% -50% sammenløb, skal du forberede følgende til tre transfektionsreaktioner:
BEMÆRK: Tag altid højde for pipetteringsfejl ved at tilføje 10% volumen ekstra.- Mærk tre 15 ml plastrør med det relevante lentivirusnavn (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M og pwPT-GFP-kontrol). Der tilsættes 1,710 ml reduceret serummedium (se materialetabel) til hvert glas.
- Fortynd 90 μL transfektionsreagens (se materialetabel) i 1,710 ml reduceret serummedium, bland ved vertexing i 2 s og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Bland emballagevektorerne; 5,1 μg psPAX2 og 2,4 μg pMDG (7,5 μg i alt).
- Emballagevektorblandingen tilsættes til transfektionsmediet (fra trin 1.4.2) og hvirvel i 2 s.
- Der tilsættes 7,5 μg af hver omprogrammeringsvektor: pSIN4-EF1a-O2S og pSIN4-CMV-K2M og pwPT-GFP-styringen til transfektionsblandingen fra trin (1.4.4) og hvirvel i 2 s.
BEMÆRK: Brug ekspressionsvektoren: viral vektor i forholdet 1: 1.
- Inkuber transfektionsrørene i 15 minutter ved stuetemperatur.
- 293T-cellerne transfekteres med hvert lentivirus ved direkte tilsætning af transfektions-DNA-blandingen fra trin (1.4.5) til mediet på dråbevis vis. Hvirvl fadet rundt for at sikre jævn fordeling over hele overfladen.
- De transfekterede celler inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 inkubator natten over.
BEMÆRK: Brug virusspecifikt affald, en metalaffaldsspand, dobbeltpose med autoklaveposer, og tag en beholder til flydende affald til virus og tilsæt en desinfektionstablet. Bortskaf alle pipetter, spidser og rør i en metalspand. Bortskaf gamle medier i en virus-flydende affaldsbeholder. Undgå at bruge glaspipetter og glasvarer for at eliminere utilsigtet viruskontaminering. - Efter 14-16 timer efter transfektion udskiftes mediet med 30 ml frisk 293T medium.
- De transfekterede celler inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 60-72 timer efter medieændring. Overhold celler dagligt og kontroller transfektionseffektiviteten ved GFP-fluorescens.
BEMÆRK: Ideelt set bør transfektionseffektiviteten være >90% ved GFP. For de andre vira bør man observere klare morfologiske ændringer af 293T-celler, da de har tendens til at blive mere runde, når de producerer viruspartikler. - Mediet fra hver virustransfektionskultur samles i 50 ml rør og drejes ned for at fjerne cellerester ved 1932 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Hver lentivirussupernatant filtreres gennem et 0,45 μM sprøjtefilter for at fjerne mindre snavs og samle det i nye 50 ml reagensglas.
- Hver lentivirussupernatant deles i 6 ml alikvoter og snapfryses hver i flydende nitrogen.
- Lentivirusprøverne opbevares ved -80 °C, indtil de er klar til brug.
2. Omprogrammering af lentivirustransduktion
- Optø primære PDAC-celler og -kultur i fuldstændigt defineret keratinocytserumfrit medium (KSFM), suppleret med bovin hypofyseekstrakt (BPE), human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF) ved 5 ng/ml og koleratoksin ved 50 ng/ml i en inkubator på 37 °C, 5% CO2 og 5 %O2 (hypoxi) (se materialetabel).
- Optø BxPc3, en pladeformet pancreas ductal adenokarcinomcellelinje og kultur i RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) ved 37 °C og 5% CO2.
- Optø H6C7-celler, bugspytkirtelkanalepitelceller og dyrkning i KSFM suppleret med BPE og EGF ved 5 ng/ml, ved 37 °C og 5% CO2.
- Optøning af humanfibroblast (hFib) og kultur i Glasgows Minimum Essential Medium (GMEM), suppleret med 10% FCS, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat og 1 mM glutamin og 0,05 mM (endelig) beta-mercaptoethanol ved 37 °C og 5% CO2.
- En dag før lentivirustransduktion (helst sent på eftermiddagen) skal du forberede to brønde i en 6-brøndplade indeholdende 100.000 celler pr. Brønd i hver af PDAC-, BxPc3-, H6C7- og hFib-celler. Inficere en brønd med OSKM lentivirus og brug den anden som en uinficeret kontrol.
BEMÆRK: Brug en separat plade til hver celletype. - Den følgende dag, om eftermiddagen (ca. 24 timer senere), skal du sørge for, at cellesammenløbet når mindst 70%, før du fortsætter til næste lentivirusinfektionstrin.
3. Lentivirustransduktion af PDAC
- Der optøs 5 ml af hver lentivirussupernatant i en virusinkubator til 37 °C.
- Forbered to 15 ml rør, der hver indeholder 2 ml forvarmet PDAC-kulturmedium.
- Til det første glas tilsættes 6 ml af hvert omprogrammeringslentivirus (pSIN4-CMV-K2M og pSIN4-EF1a-O2S) og 12 μL 4,5 mg/ml polybren (endelig 4,5 μg/ml, se materialetabellen) og blandes.
- Til det andet glas tilsættes 2 μL 4,5 mg/ml polybren (endelig 4,5 μg/ml).
- Kassér substratet fra hvert hul og vask en gang med PBS ved stuetemperatur.
- Tilføj omprogrammering infektionsmediet (rør 1) til det første hul.
- Tilsæt blandingen af rør 2 til den anden brønd. Dette vil være den uinficerede kontrol.
- Inkuber PDAC-cellerne i en 37 ° C, 5% CO2 og 5% O2 (hypoxi) inkubator natten over.
- Næste dag, om eftermiddagen, kasseres medierne fra begge brønde og erstattes med frisk PDAC-kulturmedium.
- Inkuber cellerne ved 37 °C, 5% CO2 og 5%O2 (hypoxi) i 48 timer.
4. Lentivirustransduktion af BxPc3-celler
- Der optøs 3 ml af hver lentivirussupernatant i en virusinkubator til 37 °C.
- Forbered to 15 ml rør, der hver indeholder 2 ml BxPc3 dyrkningsmedium.
- Til det første glas tilsættes 3 ml af hvert omprogrammeringslentivirus (pSIN4-CMV-K2M og pSIN4-EF1a-O2S) og 6 μL 4,5 mg/ml polybren (endelig 4,5 μg/ml) og blandes.
- Til det andet glas tilsættes 2 μL 4,5 mg/ml polybren (endelig 4,5 μg/ml).
- Kassér substratet fra hvert hul og vask en gang med PBS.
- Tilføj omprogrammering infektionsmediet (rør 1) til det første hul.
- Tilsæt blandingen af rør 2 til den anden brønd. Dette vil være den uinficerede kontrol.
- Inkuber de inficerede BxPc3-celler ved 37 °C-virus og 5% CO2 natten over.
- Næste dag, om eftermiddagen, kasseres medierne fra begge brønde og erstattes med frisk BxPc3-kulturmedium.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 48 timer.
5. Lentivirustransduktion af H6c7-celleinfektion
- 4 ml af hver lentivirussupernatant optøs i en virusinkubator til 37 °C.
- Forbered to 15 ml reagensglas, der hver indeholder 2 ml H6c7 dyrkningsmedium.
- Til det første glas tilsættes 4 ml af hvert omprogrammeringslentivirus (pSIN4-CMV-K2M og pSIN4-EF1a-O2S) og 8 μL 4,5 mg/ml polybren (endelig 4,5 μg/ml) og blandes.
- Til det andet glas tilsættes 2 μL 4,5 mg/ml polybren (endelig 4,5 μg/ml).
- Kassér mediet fra begge huller og vask én gang med PBS.
- Tilføj omprogrammering infektionsmediet (rør 1) til det første hul.
- Tilsæt blandingen af rør 2 til den anden brønd. Dette vil være den uinficerede kontrol.
- Inkuber de inficerede H6C7-celler ved 37 °C-virus og 5% CO2 natten over.
- Næste dag, om eftermiddagen, kasseres medierne fra begge brønde og erstattes med et frisk H6c7-kulturmedium.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 48 timer.
6. Lentivirustransduktion af hFib-celler
- Der optøs 2 ml af hver lentivirussupernatant i en virusinkubator til 37 °C.
- Forbered to 15 ml reagensglas, der hver indeholder 2 ml hFib-dyrkningsmedium.
- Til det første rør tilsættes 2 ml af hver omprogrammering af vira (pSIN4-CMV-K2M og pSIN4-EF1a-O2S) og tilsættes 4 μL 4,5 mg / ml polybren (endelig 4,5 μg / ml) og blandes.
- Til det andet glas tilsættes 2 μL 4,5 mg/ml polybren (endelig 4,5 μg/ml) og blandes.
- Kassér substratet fra hvert hul og vask en gang med PBS.
- Tilføj omprogrammering infektionsmediet (rør 1) til det første hul.
- Tilsæt blandingen af rør 2 til den anden brønd. Dette vil være den uinficerede kontrol.
- De inficerede hFib-celler inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 natten over.
- Næste dag, om eftermiddagen, kasseres medierne fra begge brønde og erstattes med frisk hFib-kulturmedium.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i yderligere 48 timer.
BEMÆRK: For effektiv lentivirustransduktion titerer du mængden af lentivirus omhyggeligt, da dette varierer meget mellem de forskellige celletyper. Flere lentivirustransduktioner kan være nødvendige for nogle celletyper. PDAC-cellelinjer kræver op til tre doser, mens en dosis var nok til omprogrammering af BxPc3-, H6C7- og hFib-linjer.
7. Fremstilling af iMEF-føderceller
- Der fremstilles 40 ml 0,2% gelatineopløsning ved at fortynde 1% gelatineopløsning med PBS.
- Overtræk fire plader med 6 brønde ved at dække hvert hul med 2 ml 0,2 % gelatineopløsning.
- De gelatinebelagte plader inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i mindst 30 minutter.
- Opsug den overskydende gelatineopløsning, og lad pladerne tørre under strømningshætten.
- To hætteglas (~ 4 millioner celler pr. hætteglas) bestrålet embryonal fibroblast (iMEF) med bestrålet mus ved at hvirvle det op i et 37 °C vandbad.
BEMÆRK: For at reducere risikoen for kontaminering skal du være forsigtig med at forhindre vand i at sprøjte i nærheden af hætteåbningen. Tør hætteglasset med et køkkenrulle og spray det med 70% ethanol. - I vævskulturhætten pipetteres indholdet af hvert optøet hætteglas med iMEF i et 15 ml rør indeholdende 10 ml forvarmet hFib-dyrkningsmedium på en dråbevis måde, og blandes godt ved forsigtigt at vende glasset om.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 309 x g i 3 minutter ved stuetemperatur, og fjern supernatanten fra hvert glas. Hver cellepille resuspenderes i 12 ml hFib-medium.
- Plade 2 ml celleopslæmning pr. hul på de gelatinebelagte plader med 6 huller. Fordel cellerne jævnt ved forsigtigt at ryste pladerne i alle retninger.
- Pladerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 natten over.
BEMÆRK: Forbered friske iMEF-plader 24 timer, før de bruges til omprogrammeringseksperimentet.
8. Overførsel af de inficerede celler til iMEF-føderlaget
- Kassér medier fra de inficerede og ikke-inficerede PDAC-, BxPc3-, H6c7- og hFib-celler. Hvert hul vaskes to gange med PBS ved stuetemperatur.
- Dissocier cellerne fra pladen ved at tilsætte 0,5 ml trypsin til hver brønd. Inkuber PDAC-celler i en 37 ° C, 5% CO2 og 5% O2 (hypoxi) inkubator i 15 minutter.
- Inkuber BxPc3-celler ved 37 °C og 5% CO2 i 5 minutter.
- Inkuber H6c7- og hFib-celler ved 37 °C og 5% CO2 i 4 minutter.
- Overfør den dissocierede cellesuspension fra hver brønd til 15 ml rør, der er mærket i overensstemmelse hermed som inficeret eller uinficeret.
- Cellerne høstes ved centrifugering på følgende måde: For PDAC drejes cellesuspensionen ved 300 x g i 5 minutter; for BxPc3 drejes cellesuspensionen ved 120 x g i 5 min; for H6C7 drejes cellesuspensionen ved 112 x g i 4 minutter; for hFib drejes cellesuspensionen ved 161 x g i 3 minutter. Udfør alle centrifugeringer ved stuetemperatur.
- Hver celletype pellet resuspenderes i 1 ml af det relevante dyrkningsmedie.
- iMEF-plader, der er forberedt i trin 7, vaskes med hvert celletypekulturmedie to gange. dvs. vask en plade med PDAC-medier, en med BxPc3-medier, den ene med H6C7-medium og den anden med hFib-medium.
- Plade 50.000 inficerede celler pr. brønd i fem brønde af iMEF 6-brøndplade. Plade 50.000 uinficerede kontrolceller i den resterende brønd af iMEF 6-brøndplade.
BEMÆRK: Optimer antallet af inficerede celler, der skal belægges, fra 1.000 til 50.000 celler pr. brønd. - Inkuber PDAC-celler ved 37 °C, 5% CO2 og 5%O2 (hypoxi) natten over.
- Inkuber BxPc3-, H6C7- og hFib-celler ved 37 °C og 5% CO2 natten over.
- Næste dag skal du forberede omprogrammeringsmediet som følger: Tilsæt 100 ml knockout-serumerstatning (25% endelig), 5 ml 200 mM glutamin (1 mM endelig), 5 ml 100x ikke-essentielle aminosyrer (100 μM endelig), 1,5 ml beta-mercaptoethanol (0,1 mM endelig) til 400 ml modificeret ørnemedium (DMEM).
- Opbevar omprogrammeringsmediet i 100 ml alikvoter ved 4 °C i op til 4 uger eller ved -20 °C i længere tid.
- Når den er klar til brug, tilsættes 100 μL 10 mg/ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) (10 ng/ml endelig) til et alikvote for 100 ml omprogrammeringsmedier.
- Omprogrammeringsmediet opvarmes i et 37 °C vandbad.
- Vask cellerne, der vokser på iMEFs-fødere, med forvarmede omprogrammeringsmedier to gange.
Tilsæt 2 ml omprogrammeringsmedium til hver brønd. - Omprogrammeringspladerne overføres til en inkubator på 37 °C, 5% CO2og 3 %O2 (hypoxi).
BEMÆRK: Den dag, hvor omprogrammeringsmedier tilføjes, betragtes som dag 1 i omprogrammeringen. - Foder cellerne dagligt med friske omprogrammeringsmedier, indtil iPSC-kolonier begynder at dukke op.
BEMÆRK: Identificer iPSC-kolonier ved deres ESC-lignende morfologi (kompakte kolonier med veldefinerede kanter og bestående af celler med et højt kerne/cytoplasma-forhold). - Overvåg iPSC-kolonierne dagligt, og efter at et passende antal er dannet, skal du passere dem som en pool.
BEMÆRK: Sørg for, at iPSC-kolonierne ikke rører hinanden, da dette ville resultere i differentiering og påvirke deres langsigtede stabilitet. - For at etablere klonale linjer skal du passere iPSC-puljen ca. 5 gange og derefter vælge robuste kolonier, der opretholder deres ESC-lignende morfologi.
- For at identificere fuldt omprogrammerede iPSC-kolonier skal du udføre levende farvning med TRA-160 (se materialetabel) og høste RNA fra iPSC-kolonier til karakterisering af genekspression.
9. Overførsel af iPSC-kolonier
- Forbered nok iMEF-fødeplader 24 timer, før iPSC-kolonierne passerer som beskrevet i trin 7.
- Vask iMEF-fødeplader to gange med forvarmede omprogrammeringsmedier.
- Der tilsættes 2 ml omprogrammeringsmedier suppleret med ROCK-hæmmer (Y2) (10 μM) til hvert hul med iMEF-pladen.
- iMEF-pladerne inkuberes i en inkubator på 37 °C, 5 % CO2 og 3 %O2 , indtil de er klar til brug.
- Der fremstilles opløsning af ethylendiamintetraeddikesyre/fosfatbufret saltvand (EDTA/PBS) ved fortynding af 0,5 M EDTA 1:1000 i PBS (0,5 mM endelig).
- Udskift omprogrammeringskulturmediet med 0,5 ml EDTA/PBS i hver brønd.
- Inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 og 3% O2 inkubator eller ved stuetemperatur, afhængigt af celletypen. BxPc3 og PDAC iPSC'er kræver 15 minutters inkubation ved 37 °C. H6C7 og hFib iPSC'er skal inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Kontroller iPSC-cellerne under mikroskopet, indtil de begynder at adskille sig ensartet fra føderlaget gennem hele kolonien.
- Den dissocierede iPSC-cellesuspension opsamles i et 15 ml centrifugeglas. Spin ned ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Cellepillen resuspenderes i 1 ml omprogrammeringsmedie suppleret med Y2 (10 μM).
- Pladen cellerne på iMEF-føderlaget ved at overføre hver 1 ml iPSC-cellesuspension til tre huller i iMEF-pladen.
BEMÆRK: Splitforholdet kan variere afhængigt af antallet af høstede iPSC-kolonier. - Inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 og 3% O2 inkubator.
10. Levende farvning af iPSC-kolonier med TRA-1-60
- Forbered 0,5 ml pr. hul af 4 μg/ml TRA-1-60-antistof i omprogrammeringsmedier.
- Kassér omprogrammeringsmediet, og erstat det med 0,5 ml antistofblanding i hvert hul. Inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 og 3% O2 inkubator i 30 min.
- Vask cellerne to gange med omprogrammeringsmediet.
- Tag fluorescensbilleder med et cellebilleddannelsessystem ved hjælp af GFP-filteret.
- Kontroller billedkvaliteten ved at overveje den negative kontrolkanal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative billeder, der viser morfologien af iPSC-kolonier afledt af PDAC-, BXPc3-, H6C7- og hFib-celler, er vist i figur 1. PDAC-iPSC-kolonier begyndte at danne sig på dag 25 af omprogrammering. Robuste iPSC-kolonier med en mere etableret ESC-lignende morfologi blev identificeret på dag 40 af omprogrammeringen (figur 1). På samme måde begyndte dannelsen af BxPc3-iPSC'er på dag 23 og blev mere etableret på dag 35. H6C7-iPSC-dannelsen lignede PDAC-iPSC'er og begyndte at blive etableret på dag 45. hFib-iPSC-kolonier begyndte at danne sig på dag 15 i omprogrammering.
Figur 1: Repræsentative billeder af iPSC-kolonier. Billederne viser etableret hESC-lignende morfologi afledt af (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 og (D) hFib. Omprogrammeringsdagene er angivet over hvert billede. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Klonale iPSC-linjer blev etableret fra hver omprogrammering af PDAC-, BxPc3-, H6C7- og hFib-celler. Alle etablerede iPSC-linjer farves positive for TRA-1-60, en udifferentieret hESC-celleoverflademarkør, der bekræfter deres omprogrammering til pluripotens (figur 2).
Figur 2: Repræsentative billeder af klonale iPSC-linjer. Billederne stammer fra (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 og (D) hFib, der viser ESC-lignende morfologi (toppaneler) og positiv farvning for TRA-1-60 (bundpanel). Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at lette brugen af iPSC-omprogrammering til undersøgelse af kræftprogression er der etableret en robust protokol til omprogrammering af kræftceller i bugspytkirtlen. Omprogrammering af kræftceller til pluripotens har vist sig at være meget udfordrende hidtil, da kun få undersøgelser med succes har genereret iPSC'er fra kræftceller 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. De fleste af disse undersøgelser brugte udødeliggjorte kræftcellelinjer til at generere iPSC-linjer, ikke primære patientafledte celler 36,37,38,40,42,43,44,46. For eksempel blev omprogrammering af fire forskellige leverkræftcellelinjer forsøgt ved hjælp af retroviral introduktion af OSKM-faktorer, men kun en enkelt cellelinje blev omprogrammeretmed succes 41. Imidlertid viste den genererede leverkræft iPSC-linje et tab af stamme efter et par passager, hvilket fremhævede kræftcellernes høje modstand mod OSKM-omprogrammering41. Tidligere blev der forsøgt at omprogrammere PDAC-celler ved hjælp af lentiviral levering af OSKM individuelt; Der blev dog kun genereret en enkelt iPSC-linje, afhængig af eksogen OSKM-ekspression og derfor ikke fuldt omprogrammeret37. En anden undersøgelse brugte episomale vektorer til at levere OSKM-faktorer uden genomisk integration, men formåede kun at generere en enkelt iPSC-klon fra PDAC39. Den begrænsede succes med omprogrammering af kræftceller øger de mange udfordringer, der hæmmer brugen af iPSC-teknologi i kræftforskning.
Her forklares genereringen af iPSC'er fra primære PDAC-prøver fra to forskellige patienter og en etableret PDAC-cellelinje (BxPc3). Desuden er iPSC'er også genereret fra H6c7, en pancreas ductal epitelcellelinje. Så vidt vi ved, er dette den første rapport om vellykkede afledte stabile iPSC-linjer fra BxPc3 og H6c7. Efter denne protokol er iPSC'er også med succes genereret fra primære humane fibroblaster afledt af raske individer, hvilket udvider metodens anvendelighed ud over kræftforskning.
Et af nøgleelementerne bag protokollens succes er brugen af bicistroniske lentivirale vektorer til co-express OS- og KM-faktorer. Disse vektorer indeholder det interne ribosomindgangssted 2 (IRES2) for at udtrykke OCT4 og SOX2 i den ene vektor og KLF4 og cMYC i den anden. Flere undersøgelser med monocistroniske vektorer, hvor hver omprogrammeringsfaktor blev leveret individuelt, har vist, at optagelsen af hver vektor er forskellig, hvilket påvirker OSKM-støkiometri og omprogrammeringseffektivitet47. Brug af bicistroniske vektorer kan hjælpe med at afbøde dette problem. Desuden har brugen af IRES i lentivirale vektorer vist en betydelig stigning i omprogrammeringseffektiviteten48. I dette lentivirussystem drives OS-ekspression af EF1a-promotoren, mens KM-ekspression er under kontrol af en CMV-promotor. Det er kendt, at CMV-promotoren kan udsættes for yderst effektiv hæmning ved DNA-methylering og histon-deacetylation, i modsætning til EF1a49,50. Derfor kan den tidlige dæmpning af KM før OS under omprogrammering være en nøglefaktor for protokollens succes. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser vigtigheden af OSKM-ekspressionsdynamik under omprogrammering 51,52,53,54,55. Således er den bicistroniske vektor også mere fordelagtig end den polycistroniske vektor, hvor alle OSKM-faktorer udtrykkes fra en enkelt promotor56. Andre faktorer, der bidrager til protokollens succes, inkluderer doserne af lentivirusinfektion og antallet af inficerede celler, der blev brugt til omprogrammering, som blev tilpasset til hver celletype.
Sammenfattende præsenteres en optimeret metode til omprogrammering af primære PDAC-celler sammen med andre cellelinjer og normale celler. Denne metode vil hjælpe med at udvide brugen af iPSC-omprogrammering til at modellere kræftprogression og i dette tilfælde opdage tidlige PDAC-biomarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
A.S og J.K vil gerne takke Cancer Research UK og OHSU for finansiering (CRUK-OHSU Project Award C65925 / A26986). A.S støttes af en MRC karriereudviklingspris (MR/N024028/1). AA finansieres af et ph.d.-stipendium (stipendium ref. 1078107040) fra King Abdulaziz City for Science and Technology. J.K er finansieret af MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) og Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Vi takker professor Keisuke Kaji for venligt at levere omprogrammeringsvektoren pSIN4-EF1a-O2S og pSIN4-CMV-K2M. Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY) licens på enhver Author Accepted Manuscript version som følge af denne indsendelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, Bethesda, MD. (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H.
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
