Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Перепрограммирование протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в плюрипотентность

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65811
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 4,5, 4,6, 3,6, 1
1Centre for Regenerative Medicine, Institute of Regeneration and Repair, Institute of Stem Cell Research, The University of Edinburgh, 2King Abdulaziz City for Science and Technology Health Sector (KACST), 3Cancer Early Detection Advanced Research Center, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, 4Brenden-Colson Canter for Pancreatic Care, Oregon Health & Science University, 5Department of Surgery, Oregon Health & Science University, 6Department of Molecular & Medical Genetics, Oregon Health & Science University

Summary

Настоящий протокол описывает перепрограммирование протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) и нормальных эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Мы предлагаем оптимизированную и подробную, пошаговую процедуру, от подготовки лентивируса до создания стабильных линий ИПСК.

Abstract

Генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием транскрипционных факторов была достигнута практически из любого типа дифференцированных клеток и оказалась очень ценной для исследований и клинического применения. Интересно, что ИПСК перепрограммирования раковых клеток, таких как протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), как было показано, обращает вспять инвазивный фенотип PDAC и переопределяет эпигеном рака. Дифференцировка ИПСК, полученных из PDAC, может повторить прогрессирование PDAC по сравнению с его ранним предшественником интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы (PanIN), выявляя молекулярные и клеточные изменения, которые происходят на ранних стадиях прогрессирования PDAC. Таким образом, ИПСК, полученные на основе PDAC, могут быть использованы для моделирования самых ранних стадий PDAC для выявления диагностических маркеров раннего обнаружения. Это особенно важно для пациентов с PDAC, которые обычно диагностируются на поздних метастатических стадиях из-за отсутствия надежных биомаркеров для более ранних стадий PanIN. Тем не менее, перепрограммирование линий раковых клеток, включая PDAC, в плюрипотентность остается сложным, трудоемким и сильно варьирующим между различными линиями. В данной статье мы опишем более последовательный протокол генерации ИПСК из различных клеточных линий PDAC человека с использованием лентивирусных векторов бицистроника. Полученные линии ИПСК стабильны и не зависят от экзогенной экспрессии перепрограммирующих факторов или индуцируемых препаратов. В целом, этот протокол способствует генерации широкого спектра ИПСК, полученных из PDAC, что имеет важное значение для обнаружения ранних биомаркеров, которые являются более специфичными и репрезентативными для случаев PDAC.

Introduction

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых смертельных злокачественных новообразований, и ранняя диагностика остается сложной задачей из-за бессимптомного характера заболевания. У большинства пациентов с ОАПК диагноз ставится на поздней метастатической стадии, когда возможности лечения очень ограничены 1,2. В основном это связано с отсутствием надежных биомаркеров для ранних стадий, таких как те, которые могут быть легко обнаружены в виде белков, высвобождаемых в кровоток.

PDAC может распространяться очень рано во время его прогрессирования, и лучший прогноз связан с ранним выявлением рака, когда PDAC локализуется в поджелудочной железе3. Тем не менее, менее чем у десятой части пациентов с PDAC диагностируется благоприятный прогноз, позволяющий провести хирургическую резекцию. Тем не менее, те немногие, у которых есть операбельные опухоли, также склонны к рецидиву опухоли в течение 12месяцев.

За последние пятьдесят лет были достигнуты значительные улучшения в хирургических методах, уходе за пациентами и методах лечения 5,6. Тем не менее, 5-летняя выживаемость у пациентов с хирургически резецированным ППАК едва ли возросла до 17%. Тем не менее, это все еще лучше, чем у нерезецированных пациентов, которое осталось почти неизменным (0,9%)4,7. Химиотерапия является единственным альтернативным методом лечения PDAC. Тем не менее, этот вариант очень ограничен, так как подавляющее большинство пациентов с PDAC демонстрируют сильную резистентность к химиотерапевтическим препаратам, таким как гемцитабин 7,8. Другие препараты, такие как Эрлотиниб, доступны только для небольшой группы пациентов с PDAC со специфическими мутациями, большинство из которых демонстрируют резистентность к Эрлотинибу9. Неблагоприятные побочные эффекты, связанные с химиотерапией у большинства пациентов с PDAC, являются еще одним недостатком этого лечения10. В последнее время многообещающие стратегии показали, что ингибиторы контрольных точек иммунного ответа (ICI) и ингибиторы низкомолекулярных киназ (SMKI) могут быть эффективными в лечении PDAC, но устойчивый ответ на эти таргетные методы лечения остается ограниченным меньшинством пациентов11,12. В целом, открытие ранних биомаркеров, специфичных для PDAC, может проложить новые пути для ранней диагностики и лечения.

PDAC развивается из поражений-предшественников интраэпителиальных новообразований поджелудочной железы (PanIN), которые возникают в результате неинвазивной пролиферации эпителия протоков поджелудочной железы 13,14. В то время как образование PanIN инициируется онкогенными мутациями, такими как KRAS, для прогрессирования PDAC требуются дополнительные генетические и эпигенетические изменения. Было подсчитано, что прогрессирование PanIN через различные стадии в инвазивный PDAC занимает около 10 лет 13,15,16,17. Этот период времени дает прекрасную возможность извлечь выгоду из ранней диагностики PDAC. В связи с этим были проведены обширные исследования по созданию моделей опухолевого ксенотрансплантата на животных и органоидных культур для изучения прогрессирования PDAC 18,19,20,21. Эти модели были очень полезны для изучения инвазивных стадий PDAC, но не перехода от ранних фаз PanIN. Поэтому важно разработать экспериментальные модели, которые могут повторить раннюю прогрессию стадий PanIN, чтобы позволить обнаружить биомаркеры раннего обнаружения.

Перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) с использованием четырех транскрипционных факторов OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC (OSKM) проиллюстрировало степень клеточной пластичности22. Пластичность раковых клеток была хорошо задокументирована, и перепрограммирование раковых клеток человека в ИПСК было успешно использовано для восстановления клеток до их первоначального клеточного состояния, устраняя многие эпигенетические повреждения, которые накапливались во время прогрессирования рака 23,24,25,26,27,28,29. Таким образом, возможность использования этой стратегии перепрограммирования для манипулирования идентификацией раковых клеток представляет большие перспективы в лечении рака30,31. Действительно, ранее мы показали, что дифференциация ИПСК, полученных из PDAC, может повторить прогрессирование PDAC до ранних стадий PanIN32. Путем идентификации генов и путей, специфичных для ранних и промежуточных стадий PDAC, были идентифицированы биомаркеры-кандидаты, которые могут быть клинически использованы для ранней диагностики PDAC32,33. Тем не менее, биомаркеры, обнаруженные с помощью одной линии ИПСК, показали ограниченный охват у большинства пациентов с PDAC32. Трудности с получением линий ИПСК от других пациентов с ОАПК остановили возможность обнаружения более надежных биомаркеров. Это связано со многими техническими факторами, в том числе с гетерогенностью доставки OSKM, так как только небольшая часть первичных клеток PDAC человека содержала все четыре фактора и успешно реагировала на перепрограммирование. Здесь представлен подробный протокол перепрограммирования первичных клеток PDAC с использованием более эффективной и последовательной двойной лентивирусной доставки OSKM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы экспериментов были одобрены Институциональным наблюдательным советом OHSU. Все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Все работы на животных с опухолями PDX были выполнены с одобрения Комитета по использованию и уходу за животными (IACUC) OHSU. Этот протокол был протестирован на клетках первичного PDAC из ксенотрансплантата, полученного от пациента (PDX), клеточной линии BxPc3 с морфологией эпителия, которая была выделена из ткани поджелудочной железы 61-летней пациентки с аденокарциномой, иммортализированной эпителиальной клеточной линии H6C7, полученной из нормального эпителия протоков поджелудочной железы человека, и первичных фибробластах человека, полученных из биопсии кожи здоровых людей. Образцы PDAC человека были получены в рамках исследования Oregon Pancreas Tissue Registry (IRB00003609). Информированное согласие было получено от всех субъектов. Первичные фибробласты человека были получены в RBiomedical, Эдинбург, Великобритания, из образцов кожи анонимных доноров, проходящих плановую операцию в Эдинбургской королевской больнице, Маленькая Франция, Великобритания, с их согласия и этического одобрения (09/MRE00/91). Все работы по лентивирусу были проведены в рамках исследовательской деятельности класса 2 (GM207/16.6) и одобрены Департаментом здравоохранения и безопасности Эдинбургского университета и доведены до сведения компетентного органа по охране труда и окружающей среды правительства Шотландии. Все эксперименты по перепрограммированию с использованием клеток поджелудочной железы человека проводились с этического одобрения комитета по этике Школы биологических наук Эдинбургского университета (ссылка #asoufi-0002).

1. Приготовление лентивирусов

  1. Для получения лентивируса подготавливают высококачественную упаковку и экспрессию плазмид (без эндотоксинов) с концентрациями 1-2 мкг/мкл, включая psPAX2, pMDG34 и два RES-содержащих бицистроновых вектора; кодирование pSIN4-EF1a-O2S для экспрессии OCT4 и SOX2, индуцированное промотором EF-1α, и pSIN4-CMV-K2M для экспрессии KLF4 и c-MYC под энхансером/промотором ЦМВ35 (см. таблицу материалов). Кроме того, подготовьте плазмиду pWPT-GFP для использования в качестве контроля трансфекции.
  2. Разморозьте клеточную линию эмбриональной почки человека (293T) и культуру в минимальной незаменимой среде Глазго (GMEM), дополненную 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), 1x заменимыми аминокислотами, 1 мМ пирувата натрия и 1 мМ глутамина при (см. Таблицу материалов) 37 °C и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать клетки 293T в течение четырех проходов после размораживания.
  3. Посев 293Т при плотности 3 млн. клеток на 15-сантиметровую чашку, за 24 ч до трансфекции. Всего потребуется три блюда. Предпочтительно засевать клетки во второй половине дня ~16:00.
  4. На следующий день (~16:00), когда клетки достигнут слияния ~40%-50%, подготовьте следующее для трех реакций трансфекции:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда учитывайте ошибку пипетирования, добавляя 10% дополнительного объема.
    1. Маркируйте три пластиковые пробирки объемом 15 мл соответствующим названием лентивируса (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M и pwPT-GFP контроль). Добавьте в каждую пробирку 1,710 мл восстановленной сывороточной среды (см. таблицу материалов).
    2. Развести 90 мкл трансфекционного реагента (см. таблицу материалов) в 1,710 мл восстановленной сывороточной среды, перемешать вертексом в течение 2 с и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Смешайте векторы упаковки; 5,1 мкг psPAX2 и 2,4 мкг pMDG (всего 7,5 мкг).
    4. Добавьте упаковочную векторную смесь в среду для трансфекции (из шага 1.4.2) и перемешайте в течение 2 с.
    5. Добавляют по 7,5 мкг каждого вектора перепрограммирования: pSIN4-EF1a-O2S и pSIN4-CMV-K2M и контрольного pwPT-GFP в трансфекционную смесь со стадии (1.4.4) и вихряют в течение 2 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вектор экспрессии: вирусный вектор в соотношении 1:1.
  5. Инкубируйте трансфекционные пробирки в течение 15 минут при комнатной температуре.
  6. Трансфицируйте клетки 293T с каждым лентивирусом, непосредственно добавляя смесь трансфекции и ДНК из стадии (1.4.5) в среду по каплям. Встряхните блюдо, чтобы обеспечить равномерное распределение по всей поверхности.
  7. Инкубируйте трансфицированные клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%CO2 в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте специфические для вируса отходы, металлическое ведро для утилизации, двойной мешок с автоклавными пакетами, а также возьмите контейнер для жидких отходов для вирусов и добавьте дезинфицирующую таблетку. Утилизируйте все пипетки, наконечники и тюбики в металлическом ведре. Утилизируйте старые носители в контейнер для жидких отходов с вирусами. Избегайте использования стеклянных пипеток и стеклянной посуды для предотвращения случайного заражения вирусами.
  8. Через 14-16 ч после трансфекции замените среду 30 мл свежей среды 293T.
  9. Инкубируют трансфицированные клетки при 37 °C, 5%CO2 в течение 60-72 ч после смены среды. Ежедневно наблюдайте за клетками и проверяйте эффективность трансфекции с помощью флуоресценции GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале эффективность трансфекции должна составлять >90% по GFP. Для остальных вирусов следует наблюдать явные морфологические изменения 293Т-клеток, так как при образовании вирусных частиц они имеют тенденцию становиться более округлыми.
  10. Соберите среду из каждой культуры для трансфекции вируса в пробирки по 50 мл и открутите вниз, чтобы удалить клеточный мусор при 1932 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  11. Отфильтруйте каждую надосадочную жидкость лентивируса через шприцевой фильтр 0,45 мкМ, чтобы удалить более мелкий мусор и собрать его в новые пробирки объемом 50 мл.
  12. Разделите каждую лентивирусную надосадочную жидкость на аликвоты по 6 мл и мгновенно заморозьте каждую в жидком азоте.
  13. Храните лентивирусные аликвоты при температуре -80 °C до использования.

2. Перепрограммирование лентивирусной трансдукции

  1. Размораживают первичные клетки и культуру PDAC в полностью определенной среде сыворотки кератиноцитов (KSFM), дополненной экстрактом бычьего гипофиза (BPE), человеческим рекомбинантным эпидермальным фактором роста (EGF) в дозе 5 нг/мл и холерным токсином в концентрации 50 нг/мл при 37 °C, 5% CO2 и 5% O2 (гипоксия) инкубаторе (см. таблицу материалов).
  2. Разморозьте BxPc3, клеточную линию плоскоклеточной протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, и культуру в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) при 37 °C и 5% CO2.
  3. Размораживание клеток H6C7, клеток протокового эпителия поджелудочной железы и культивирование в КСФМ с добавлением BPE и EGF в концентрации 5 нг/мл, при 37 °C и 5% CO2.
  4. Разморозьте фибробласты человека (hFib) и культуру в минимальной незаменимой среде (GMEM) Глазго, дополненные 10% FCS, 1x заменимыми аминокислотами, 1 мМ пирувата натрия и 1 мМ глутамина, а также 0,05 мМ (конечный) бета-меркаптоэтанола при 37 °C и 5% CO2.
  5. За день до трансдукции лентивируса (желательно ближе к вечеру) подготовьте две лунки из 6-луночной пластины, содержащей по 100 000 клеток в каждой лунке из клеток PDAC, BxPc3, H6C7 и hFib. Одну скважину заражать лентивирусами OSKM, а вторую использовать в качестве незараженного контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте отдельную пластину для каждого типа клеток.
  6. На следующий день, во второй половине дня (примерно через 24 часа), убедитесь, что слияние клеток достигло не менее 70%, прежде чем переходить к следующему этапу лентивирусной инфекции.

3. Лентивирусная трансдукция PDAC

  1. Разморозьте по 5 мл каждого лентивирусной надосадочной жидкости в инкубаторе с температурой 37 °C.
  2. Приготовьте две пробирки по 15 мл, каждая из которых содержит 2 мл предварительно подогретой питательной среды PDAC.
  3. В первую пробирку добавляют по 6 мл каждого перепрограммируемого лентивируса (pSIN4-CMV-K2M и pSIN4-EF1a-O2S) и 12 мкл полибрена 4,5 мг/мл (конечное 4,5 мкг/мл, см. таблицу материалов) и перемешивают.
  4. Во вторую пробирку добавьте 2 мкл полибрена 4,5 мг/мл (конечная концентрация 4,5 мкг/мл).
  5. Вылейте средство из каждой лунки и промойте один раз PBS при комнатной температуре.
  6. Добавьте перепрограммирующую инфекционную среду (пробирка 1) в первую лунку.
  7. Добавьте смесь из пробирки 2 во вторую лунку. Это и будет незараженный контроль.
  8. Инкубируйте клетки PDAC в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2 и 5%O2 (гипоксия) в течение ночи.
  9. На следующий день, во второй половине дня, выбросьте среду из обеих лунок и замените ее свежей питательной средой PDAC.
  10. Инкубируют клетки при 37 °C, 5%CO2 и 5%O2 (гипоксия) в течение 48 ч.

4. Лентивирусная трансдукция клеток BxPc3

  1. Разморозьте 3 мл каждого лентивирусной надосадочной жидкости в вирусном инкубаторе с температурой 37 °C.
  2. Подготовьте две пробирки по 15 мл, каждая из которых содержит 2 мл питательной среды BxPc3.
  3. В первую пробирку добавляют по 3 мл каждого перепрограммирующего лентивируса (pSIN4-CMV-K2M и pSIN4-EF1a-O2S) и 6 мкл полибрена 4,5 мг/мл (конечный 4,5 мкг/мл) и перемешивают.
  4. Во вторую пробирку добавьте 2 мкл полибрена 4,5 мг/мл (конечная концентрация 4,5 мкг/мл).
  5. Выбросьте средство из каждой лунки и промойте один раз PBS.
  6. Добавьте перепрограммирующую инфекционную среду (пробирка 1) в первую лунку.
  7. Добавьте смесь из пробирки 2 во вторую лунку. Это и будет незараженный контроль.
  8. Инкубируют инфицированные клетки BxPc3 при 37 °C вирусе и 5%CO2 в течение ночи.
  9. На следующий день, во второй половине дня, выбросьте среду из обеих лунок и замените ее свежей питательной средой BxPc3.
  10. Инкубируют клетки при 37 °C и 5%CO2 в течение 48 ч.

5. Лентивирусная трансдукция инфекции клеток H6c7

  1. Разморозьте 4 мл каждого лентивирусной надосадочной жидкости в вирусном инкубаторе с температурой 37 °C.
  2. Подготовьте две пробирки по 15 мл, каждая из которых содержит 2 мл питательной среды H6c7.
  3. В первую пробирку добавляют по 4 мл каждого перепрограммирующего лентивируса (pSIN4-CMV-K2M и pSIN4-EF1a-O2S) и 8 мкл полибрена 4,5 мг/мл (конечный 4,5 мкг/мл) и перемешивают.
  4. Во вторую пробирку добавьте 2 мкл полибрена 4,5 мг/мл (конечная концентрация 4,5 мкг/мл).
  5. Выбросьте средство из обеих лунок и промойте один раз PBS.
  6. Добавьте перепрограммирующую инфекционную среду (пробирка 1) в первую лунку.
  7. Добавьте смесь из пробирки 2 во вторую лунку. Это и будет незараженный контроль.
  8. Инкубируют инфицированные клетки H6C7 при температуре вируса 37 °C и 5%CO2 в течение ночи.
  9. На следующий день, во второй половине дня, выбросьте среду из обеих лунок и замените ее свежей питательной средой H6c7.
  10. Инкубируют клетки при 37 °C и 5%CO2 в течение 48 ч.

6. Лентивирусная трансдукция клеток hFib

  1. Разморозьте 2 мл каждого лентивирусного надосадочного раствора в вирусинкубаторе при температуре 37 °C.
  2. Подготовьте две пробирки по 15 мл, каждая из которых содержит 2 мл питательной среды hFib.
  3. В первую пробирку добавляют по 2 мл каждого перепрограммирующего вируса (pSIN4-CMV-K2M и pSIN4-EF1a-O2S) и добавляют 4 мкл полибрена 4,5 мг/мл (конечный 4,5 мкг/мл) и перемешивают.
  4. Во вторую пробирку добавляют 2 мкл полибрена 4,5 мг/мл (конечная конечная 4,5 мкг/мл) и перемешивают.
  5. Выбросьте средство из каждой лунки и промойте один раз PBS.
  6. Добавьте перепрограммирующую инфекционную среду (пробирка 1) в первую лунку.
  7. Добавьте смесь из пробирки 2 во вторую лунку. Это и будет незараженный контроль.
  8. Инкубируют инфицированные клетки hFib при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение ночи.
  9. На следующий день, во второй половине дня, выбросьте среду из обеих лунок и замените ее свежей питательной средой hFib.
  10. Инкубируют клетки при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение следующих 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективной трансдукции лентивируса тщательно определяйте титр количества лентивируса, так как оно сильно варьируется в зависимости от типа клеток. Для некоторых типов клеток может потребоваться множественная лентивирусная трансдукция. Клеточные линии PDAC требуют до трех доз, в то время как для перепрограммирования линий BxPc3, H6C7 и hFib достаточно одной дозы.

7. Подготовка фидерных ячеек iMEF

  1. Приготовьте 40 мл 0,2% раствора желатина, разбавив 1% раствор желатина PBS.
  2. Покройте четыре 6-луночные планшеты, покрыв каждую лунку 2 мл 0,2% раствора желатина.
  3. Инкубируйте пластины, покрытые желатином, при температуре 37 °C и 5%CO2 не менее 30 мин.
  4. Отсосите излишки желатинового раствора и оставьте пластины сохнуть под проточным колпаком.
  5. Разморозьте две пробирки (~ 4 миллиона клеток на флакон) облученного эмбрионального фибробласта мыши (iMEF), взбалтывая его на водяной бане с температурой 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить вероятность загрязнения, будьте осторожны, чтобы вода не разбрызгивалась рядом с отверстием крышки. Высушите флакон бумажным полотенцем и опрыскайте его 70% этиловым спиртом.
  6. В вытяжке для культивирования тканей пипеткой переложите содержимое каждого размороженного флакона iMEFs в одну пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл предварительно подогретой питательной среды hFib, по каплям и хорошо перемешайте, осторожно переворачивая пробирку.
  7. Открутите клеточную суспензию при концентрации 309 x g в течение 3 минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость из каждой пробирки. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в среде hFib объемом 12 мл.
  8. Планшет 2 мл клеточной суспензии на лунку 6-луночных планшетов с желатиновым покрытием. Равномерно распределите ячейки, аккуратно встряхивая пластины во всех направлениях.
  9. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежие пластины iMEF за 24 часа до использования в эксперименте по перепрограммированию.

8. Перенос инфицированных клеток на фидерный слой iMEF

  1. Удалите носители из зараженных и неинфицированных ячеек PDAC, BxPc3, H6c7 и hFib. Промойте каждую лунку дважды PBS при комнатной температуре.
  2. Отделите клетки от планшета, добавив 0,5 мл трипсина в каждую лунку. Инкубируют клетки PDAC в инкубаторе 37 °C, 5%CO2 и 5%O2 (гипоксия) в течение 15 мин.
  3. Инкубируют клетки BxPc3 при 37 °C и 5%CO2 в течение 5 мин.
  4. Инкубируют клетки H6c7 и hFib при 37 °C и 5% CO2 в течение 4 мин.
  5. Перелейте диссоциированную клеточную суспензию из каждой лунки в пробирки по 15 мл, помеченные соответственно как инфицированные или неинфицированные.
  6. Собирают клетки центрифугированием следующим образом: для PDAC отжимают клеточную суспензию при 300 x g в течение 5 мин; для BxPc3 отжим клеточную суспензию при 120 x g в течение 5 мин; для H6C7 вращайте клеточную суспензию при 112 x g в течение 4 минут; для hFib вращайте клеточную суспензию при 161 x g в течение 3 мин. Выполняйте все центрифугирования при комнатной температуре.
  7. Ресуспендант гранул каждого типа клеток в 1 мл соответствующей питательной среды.
  8. Промойте планшеты iMEF, подготовленные на этапе 7, питательными средами для каждого типа клеток дважды. т.е. промыть одну пластину средой PDAC, одну - средой BxPc3, одну - средой H6C7, а третью - средой hFib.
  9. Пластина 50 000 инфицированных клеток на лунку в пяти лунках 6-луночной пластины iMEF. Поместите 50 000 неинфицированных контрольных клеток в оставшуюся одну лунку 6-луночного планшета iMEF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте количество инфицированных клеток с 1 000 до 50 000 клеток на лунку.
  10. Инкубируйте клетки PDAC при 37 °C, 5%CO2 и 5%O2 (гипоксия) в течение ночи.
  11. Инкубируйте клетки BxPc3, H6C7 и hFib при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение ночи.
  12. На следующий день приготовьте среду для перепрограммирования следующим образом: добавьте 100 мл нокаутирующей сыворотки (25% конечного), 5 мл 200 мМ глутамина (1 мМ финал), 5 мл 100-кратно заменимых аминокислот (100 мкМ конечного), 1,5 мл бета-меркаптоэтанола (0,1 мМ конечного) до 400 мл модифицированной орлиной среды (DMEM).
  13. Храните носитель для перепрограммирования в аликвотах по 100 мл при 4 °C до 4 недель или при -20 °C дольше.
  14. Когда все будет готово к использованию, добавьте 100 мкл 10 мг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) (10 нг/мл конечного) к одной аликвоте 100 мл перепрограммирующей среды.
  15. Нагрейте перепрограммирующий носитель на водяной бане с температурой 37 °C.
  16. Клетки, растущие на кормушках iMEF, дважды промыть предварительно нагретой перепрограммирующей средой.
    Добавьте 2 мл среды для перепрограммирования в каждую лунку.
  17. Переложите перепрограммирующие планшеты в инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2и 3%O2 (гипоксия).
    ПРИМЕЧАНИЕ: День добавления носителя для перепрограммирования считается днем 1 перепрограммирования.
  18. Ежедневно подкармливайте клетки свежей репрограммирующей средой до тех пор, пока не начнут появляться колонии ИПСК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идентифицируйте iPSC-колонии по их ESC-подобной морфологии (компактные колонии с четко очерченными краями, состоящие из клеток с высоким соотношением ядро/цитоплазма).
  19. Ежедневно наблюдайте за колониями ИПСК, а после того, как будет сформировано достаточное количество, пассируйте их в виде бассейна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы колонии ИПСК не соприкасались друг с другом, так как это приведет к дифференцировке и повлияет на их долгосрочную стабильность.
  20. Чтобы установить клональные линии, пройдите пул ИПСК около 5 раз, затем выберите устойчивые колонии, которые сохраняют свою морфологию, подобную ЭСК.
  21. Для идентификации полностью перепрограммированных колоний ИПСК проводят живое окрашивание с помощью TRA-160 (см. таблицу материалов) и извлекают РНК из колоний ИПСК для характеризации экспрессии генов.

9. Пассаж колоний ИПСК

  1. Подготовьте достаточное количество фидерных пластин iMEF за 24 часа до прохождения колоний iPSC, как описано в шаге 7.
  2. Дважды промойте пластины питателя iMEF предварительно нагретым носителем для перепрограммирования.
  3. Добавьте 2 мл перепрограммирующей среды, дополненной ингибитором ROCK (Y2) (10 мкМ), в каждую лунку пластины iMEF.
  4. Инкубируйте планшеты iMEF в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%CO2 и 3%O2 до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.
  5. Приготовьте раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты / фосфатного буферного солевого раствора (ЭДТА/ПБС), разбавив 0,5 М ЭДТА 1:1000 в ПБС (0,5 мМ конечный).
  6. Замените перепрограммируемую питательную среду 0,5 мл ЭДТА/ПБС в каждой лунке.
  7. Инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2 и 3%O2 или при комнатной температуре, в зависимости от типа клетки. ИПСК BxPc3 и PDAC требуют 15-минутной инкубации при 37 °C. ИПСК H6C7 и hFib необходимо инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
  8. Проверяйте клетки ИПСК под микроскопом до тех пор, пока они не начнут равномерно диссоциировать от фидерного слоя по всей колонии.
  9. Соберите диссоциированную клеточную суспензию ИПСК в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Отжим при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
  10. Ресуспендант клеточной гранулы в 1 мл перепрограммирующей среды с добавлением Y2 (10 мкМ).
  11. Наносите ячейки на фидерный слой iMEF, перенося каждый 1 мл клеточной суспензии iPSC в три лунки пластины iMEF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разделения может варьироваться в зависимости от количества собранных колоний ИПСК.
  12. Инкубируют в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%CO2 и 3%O2 .

10. Живое окрашивание колоний ИПСК TRA-1-60

  1. Приготовьте 0,5 мл на лунку 4 мкг/мл антитела TRA-1-60 в перепрограммирующей среде.
  2. Выбросьте перепрограммирующую среду и замените ее смесью антител по 0,5 мл в каждой лунке. Инкубировать в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2 и 3%O2 в течение 30 мин.
  3. Промойте ячейки дважды с помощью перепрограммирующей среды.
  4. Получение флуоресцентных изображений с помощью системы визуализации клеток с использованием фильтра GFP.
  5. Проверьте качество изображения, рассмотрев отрицательный канал управления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 представлены репрезентативные изображения, отображающие морфологию колоний iPSC, полученных из клеток PDAC, BXPc3, H6C7 и hFib. Колонии PDAC-iPSC начали формироваться на 25-й день перепрограммирования. Устойчивые iPSC-колонии с более устоявшейся ESC-подобной морфологией были идентифицированы на 40-й день перепрограммирования (рис. 1). Аналогичным образом, формирование BxPc3-iPSCs началось на 23-й день и стало более устойчивым к 35-му дню. Образование H6C7-iPSC было похоже на PDAC-iPSCs и начало налаживаться на 45-й день. Колонии hFib-iPSC начали формироваться на 15-й день перепрограммирования.

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные изображения колоний ИПСК. На изображениях показана установленная hESC-подобная морфология, полученная из (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 и (D) hFib. Дни перепрограммирования указаны над каждым изображением. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Клональные линии iPSC были установлены при каждом перепрограммировании клеток PDAC, BxPc3, H6C7 и hFib. Все установленные линии ИПСК окрашены положительно на TRA-1-60, недифференцированный маркер клеточной поверхности чЭСК, что подтверждает их перепрограммирование на плюрипотентность (рис. 2).

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные изображения клональных линий ИПСК. Изображения получены из (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 и (D) hFib с ESC-подобной морфологией (верхние панели) и положительным окрашиванием для TRA-1-60 (нижняя панель). Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Чтобы облегчить использование ИПСК для изучения прогрессирования рака, был разработан надежный протокол перепрограммирования раковых клеток поджелудочной железы. Перепрограммирование раковых клеток в плюрипотентность до сих пор оказалось очень сложной задачей, поскольку только в нескольких исследованиях были успешно получены ИПСК из раковых клеток 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. В большинстве этих исследований для получения линий ИПСК использовались иммортализированные линии раковых клеток, а не первичные клетки, полученные от пациентов 36,37,38,40,42,43,44,46. Например, была предпринята попытка перепрограммирования четырех различных клеточных линий рака печени с использованием ретровирусного введения факторов OSKM, но только одна клеточная линия была успешноперепрограммирована. Тем не менее, сгенерированная линия ИПСК рака печени показала потерю стволовости после нескольких пассажей, что подчеркивает высокую устойчивость раковых клеток к перепрограммированию OSKM41. Ранее предпринимались попытки перепрограммировать клетки PDAC с использованием лентивирусной доставки OSKM по отдельности; однако была сгенерирована только одна линия ИПСК, зависящая от экзогенной экспрессии OSKM и, следовательно, не полностью перепрограммированная37. В другом исследовании использовались эписомальные векторы для доставки факторов OSKM без геномной интеграции, но удалось создать только один клон iPSC из PDAC39. Ограниченный успех в перепрограммировании раковых клеток усугубляет множество проблем, препятствующих использованию технологии ИПСК в исследованиях рака.

В этой статье объясняется генерация ИПСК из первичных образцов PDAC, полученных от двух разных пациентов и одной установленной клеточной линии PDAC (BxPc3). Кроме того, ИПСК также были получены из H6c7, линии клеток протокового эпителия поджелудочной железы. Насколько нам известно, это первое сообщение об успешно полученных стабильных линиях ИПСК из BxPc3 и H6c7. В соответствии с этим протоколом ИПСК также были успешно получены из первичных фибробластов человека, полученных от здоровых людей, что расширило применимость метода за пределы исследования рака.

Одним из ключевых элементов успеха протокола является использование лентивирусных векторов бицистроника для коэкспрессии факторов ОВ и КМ. Эти векторы содержат внутренний сайт входа рибосом 2 (IRES2) для экспрессии OCT4 и SOX2 в одном векторе и KLF4 и cMYC в другом. Многочисленные исследования с использованием моноцистронных векторов, в которых каждый фактор перепрограммирования вводился индивидуально, показали, что поглощение каждого вектора различно, что влияет на стехиометрию OSKM и эффективность перепрограммирования47. Использование бицистроновых векторов может помочь смягчить эту проблему. Кроме того, использование IRES в лентивирусных векторах показало значительное повышение эффективности перепрограммирования48. В этой лентивирусной системе экспрессия ОС управляется промотором EF1a, в то время как экспрессия КМ находится под контролем промотора ЦМВ. Известно, что промотор ЦМВ может быть подвергнут высокоэффективному сайленсингу путем метилирования ДНК и деацетилирования гистонов, в отличие от EF1a49,50. Таким образом, раннее заглушение КМ перед ОС во время перепрограммирования может быть ключевым фактором успеха протокола. Это согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими важность динамики экспрессии OSKM при перепрограммировании 51,52,53,54,55. Таким образом, бицистронный вектор также более выгоден, чем полицистронный вектор, в котором все факторы OSKM выражаются из одного промотора56. Другие факторы, способствующие успеху протокола, включают дозы лентивирусной инфекции и количество инфицированных клеток, используемых для перепрограммирования, которые были адаптированы для каждого типа клеток.

Таким образом, представлен оптимизированный метод перепрограммирования первичных клеток PDAC вместе с другими клеточными линиями и нормальными клетками. Этот метод поможет расширить использование перепрограммирования ИПСК для моделирования прогрессирования рака и, в данном случае, обнаружить ранние биомаркеры PDAC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

А.С. и Дж.К. благодарят Cancer Research UK и OHSU за финансирование (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S получает награду MRC за развитие карьеры (MR/N024028/1). Программа A.A финансируется за счет стипендии доктора философии (стипендия 1078107040) от Города науки и технологий имени короля Абдул-Азиза. J.K финансируется грантом MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) и грантом Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Мы благодарим профессора Кэйсукэ Кадзи за любезное предоставление векторов перепрограммирования pSIN4-EF1a-O2S и pSIN4-CMV-K2M. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, принятой автором, возникшей в результате этой заявки.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50 mM) Thermo Fisher 31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R BioLegend 330613
Bovine Pituitary Extract (BPE) Thermo Fisher 13028014
BxPc3 ATCC CRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Merck  C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tail Merck  C3867
Completed Defined K-SFM Thermo Fisher  10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates Merck  CLS3516
Corning syringe filters Merck  CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishes Merck  CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets Thermo Fisher 12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) Merck  D8537
Fetal Calf Serum (FCS)  Thermo Fisher 10270-106
Fugene HD Transfection Reagent  Promega   E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O Merck  G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) Merck  G5154
Human EGF Recombinant Protein Thermo Fisher PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech Thermo Fisher 100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) Kerafast ECA001-FP
iMEF feeder cells  iXcells Biotechnologies 10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)  Thermo Fisher 17005-042
KnockOut DMEM  Thermo Fisher 10829018
KnockOut serum Replacement  Thermo Fisher 10828028
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) Merck  SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium  Thermo Fisher 31985062
pMDG  AddGene 187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide)  Merck  H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M  AddGene 21164
pSIN4-EF2-O2S  AddGene 21162
psPAX2 AddGene 12260
pWPT-GFP  AddGene 12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification) Thermo Fisher A1049101
Sodym Pyruvate Thermo Fisher 11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL)  Thermo Fisher 15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher 12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies 72304

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
  2. Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
  3. Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, Bethesda, MD. (2016).
  4. Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
  5. He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
  6. Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
  7. Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
  8. Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
  9. Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
  10. Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
  11. Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
  12. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
  13. Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
  14. Maitra, A., Hruban, R. H. Pancreatic cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 157-188 (2008).
  15. Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M. Pancreatic cancer. The Lancet. 378 (9791), 607-620 (2011).
  16. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  17. Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
  18. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
  19. Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
  20. Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
  21. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  22. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  23. Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
  24. Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  25. Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
  26. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  27. Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
  28. Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
  29. Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
  30. Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
  31. Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
  32. Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
  33. Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
  34. Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
  35. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  36. Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
  37. Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
  38. Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
  39. Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
  40. Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
  41. Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
  42. Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
  43. Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
  44. Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
  45. Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
  46. Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
  47. Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
  48. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  49. Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
  50. Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
  51. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  52. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  53. Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
  54. Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
  55. Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
  56. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).

Tags

Исследования рака выпуск 204
Перепрограммирование протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в плюрипотентность
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alshaikh, A., Grygoryev, D., Keith,… More

Alshaikh, A., Grygoryev, D., Keith, D., Sheppard, B., Sears, R. C., Kim, J., Soufi, A. Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency. J. Vis. Exp. (204), e65811, doi:10.3791/65811 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter