على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic
Abstract
أرشيف المكتبات Metagenomic شظايا كبيرة من تسلسل الجيني متجاورة من الكائنات الدقيقة دون الحاجة إلى زراعة السابقة. توليد إجراء مبسط لإنشاء مكتبات والفرز metagenomic بالتالي مفيدة للتحقيقات عالية الكفاءة الإنتاجية في الخصائص الوراثية والتمثيل الغذائي لتجمعات الجراثيم غير مثقف. هنا ، تعرض البروتوكولات الرئيسية في الفيديو ، الذي نقترحه هو الشكل الأكثر فائدة لوصف دقيق لعملية طويلة تعتمد على الأجهزة الروبوتية بالتناوب والتدخلات اليدوية (الإنسان). أولا ، استخدمنا الروبوتات على الفور على استنساخ مكتبة macroarray الأغشية ذات الكثافة السكانية العالية ، كل منها يمكن أن تحتوي على المستعمرات مكررة 20-4 لوحات المكتبة 384 أيضا. أتمتة أمر ضروري لهذا الإجراء ليس فقط من أجل الدقة والسرعة ، ولكن أيضا بسبب صغر الحجم المطلوب لاحتواء عدد كبير من الحيوانات المستنسخة في مكتبة الترتيبات المكانية كثيفة للغاية. ولدت مرة واحدة ، ونحن تظاهر القادمة كيف يمكن فحص الأغشية macroarray عن الجينات ذات الاهتمام باستخدام نسخ معدلة من البروتوكولات القياسية لوسم التحقيق التهجين الغشاء ، والكشف عن الإشارة. نحن تستكمل المظاهرة البصرية من هذه الإجراءات مع أوصاف مكتوبة مفصلة من الخطوات المعنية والمواد المطلوبة ، وكلها متاحة على شبكة الإنترنت جنبا إلى جنب مع الفيديو.
Protocol
Discussion
لم يتم تجريد الإجراء الأمثل. ومع ذلك ، فإن الإجراء الوارد في تجريد تعليمات الشركة المصنعة (2 يغسل كل من ، في 10 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، و 1 من 1 يغسل ساعة عند 60 درجة مئوية في 0.5 ٪ SDS) غير كافية. على الأقل الحضانة بين عشية وضحاها في الإيثانول بنسبة 100 ٪ من الضروري حل ناتج التفاعل ECF ?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
