Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar
Abstract
Metagenomic kütüphanelerde arşiv önce ekimi gerektirmeden mikroorganizmalardan bitişik genomik dizilerinin büyük parçaları. Metagenomic kütüphaneler oluşturulması ve tarama için akıcı bir prosedür oluşturma kültürsüz mikrobiyal topluluklarının genetik ve metabolik özelliklerini içine verimli, yüksek verimli araştırmalar için yararlıdır. Burada, anahtar protokolleri, dönüşümlü olarak robotik enstrümantasyon ve (insan) manuel müdahaleler bağlıdır uzun bir süreç doğru bir şekilde tanımlamak için en yararlı biçimde. Öneriyoruz video sunulmaktadır. Birincisi, biz, yirmi dört 384-iyi kütüphane plakalar yinelenen koloniler içerebilir, her biri yüksek yoğunluklu macroarray membranlar üzerine kütüphane klonlar, nokta robotik istihdam. Otomasyon da çok yoğun mekansal düzenlemeler, çok sayıda kütüphane klonların sığdırmak için gerekli ölçek minyatürleştirme nedeniyle hassasiyet ve hız için sadece bu işlem için gerekli, ancak. Bir kere üretilen, önümüzdeki macroarray membranlar prob etiketleme, membran hibridizasyon ve sinyal tespiti için standart protokoller değiştirilmiş sürümlerini kullanarak ilgi genlerin nasıl gösterildi gösterdi. Biz online video yanında tüm bunların ayrıntılı bir yazılı ilgili adımları açıklamaları ve gerekli malzemeler, görsel bir gösteri ile bu işlemler tamamlanmaktadır.
Protocol
Discussion
Soyma işlemi optimize edilmemiştir. Ancak, üreticinin talimatı (2 yıkar, her biri 10 dakika, 1 saat 60 ° C 'de% 0.5 SDS% 100 etanol içinde 1 yıkama) verilen soyma işlemi yetersizdir. Gecede en az% 100 etanol inkübasyon ECF reaksiyon ürünü çözmek için gereklidir;% 100 etanol birkaç gün kuluçka membran reprobe yeteneği üzerinde hiçbir olumsuz etkisi var gibi görünüyor. Ayrıca üretici SDS tedavi yetersiz görünüyor. Nufkullanıcısının 80 1 saat çalıştı ° C,% 0.5 'SDS bir tedavi ile başarı ile yak?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
