Bu video protokol transgenik üretmek için bir yöntem gösteriyor<em> Xenopus laevis</em> Döllenmemiş yumurta içine nükleer transplantasyonu takiben sperm çekirdekleri transgenlerin giriş.
Xenopus genom içine klonlanmış genlerin ürünleri istikrarlı entegrasyon, ifadenin zaman ve yerde kontrol etmek, daha sonraki aşamada embriyonik gelişim genleri ifade etmek ve arttırıcılar ve destekçileri embriyo içinde gen ekspresyonu düzenleyen nasıl tanımlamak için gereklidir . Burada gösterilen protokol transgenik Xenopus laevis embriyolar verimli üretmek için kullanılabilir. 1: Bu transgenesis yaklaşım üç bölümden oluşur. Sperm çekirdekleri yetişkin X izole edilir laevis testiste sperm plazma membranı permeabilizes lysolecithin ile tedavi. 2. Yumurta özü düşük hızda santrifüj, hücre döngüsünün interfaz ilerleme özü neden ek kalsiyum ve interfaz sitoplazmada izole etmek için yüksek hızda santrifüj tarafından hazırlanmıştır. 3. Nükleer transplantasyonu: çekirdekleri ve özü transgen ve küçük bir miktar kısıtlama enzim olarak tanıtıldı Lineerleştirilmiş plazmid DNA ile birleştirilir. Kısa bir reaksiyon sırasında, yumurta ekstresi kısmen, sperm kromatin decondenses ve restriksiyon enzimi, genom, transgen rekombinasyon teşvik kromozom tatili üretir. Tedavi sperm çekirdekleri daha sonra döllenmemiş yumurta naklediliyor. Transgen Entegrasyonu genellikle önce Oluşan embriyolar kimerik olmadığı gibi ilk embriyonik bölünme oluşur. Bu embriyolar transgenik embriyoların, organizatörü ve gen fonksiyonu analizler için etkin ve hızlı bir nesil için izin veren yeni nesil, üremek için herhangi bir ihtiyaç olmadan analiz edilebilir. Yetişkin X Bu yordamı kaynaklanan laevis transgen germline yoluyla yaymak ve farklı amaçlar için transgenik hayvanlar hatları oluşturmak için kullanılan olabilir.
Her transgenik inşa test edilmesi için, biz genel olarak 500-1000 yumurta içine çekirdekleri nakli, bu ölçekte, yumurtalarını bırakmak için ne kadar çok sayıda kadın indüklenen bağlı olarak, günde 10 kadar farklı yapıları ifade transgenik embriyolar üretebilir. Bu transplantasyon ki, yumurta tutunmaya yaklaşık üçte birini ve bu yarma embriyoların% 60-80 normalde gastrulasyon üzerinden geçin. Bu embriyoların% 10-50 arasında kullanılan reaksiyon şartlarına bağlı olarak faiz transgen ifad…
The authors have nothing to disclose.
Çalışması için fonlar NIH, Dimes, Mart ve Amerikan Kanser Derneği tarafından sağlanmaktadır.
A.Sperm nuclei preparation
Reagents:
Equipment:
B. Preparation of High Speed Extract
Reagents:
Equipment:
C. Nuclear transplantation.
Reagents:
Equipment:
Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4°C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.
Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.
Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.
Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)