Summary
Om tegemoet te komen aan dringende behoeften op het gebied van dengue-diagnostiek, introduceren we hier een in de smartphone-app geïntegreerd Dengue NS1 Paper-based Analytical Device (DEN-NS1-PAD) voor het kwantificeren van de Dengue NS1-antigeenconcentratie in klinische serum-/bloedmonsters. Deze innovatie verbetert de behandeling van dengue door te helpen bij de klinische besluitvorming in verschillende zorgomgevingen, zelfs in omgevingen met beperkte middelen.
Abstract
Infectie met het denguevirus (DENV), die wordt overgedragen door Aedes-muggen , is een groot probleem voor de volksgezondheid in tropische en subtropische landen. Met een jaarlijkse incidentie van ongeveer 10 miljoen gevallen en 20.000-25.000 sterfgevallen, vooral onder kinderen, is er dringend behoefte aan praktische diagnostische hulpmiddelen. De aanwezigheid van dengue niet-structureel proteïne 1 (NS1) tijdens vroege infectie is in verband gebracht met het vrijkomen van cytokines, vasculaire lekkage en endotheeldisfunctie, waardoor het een potentiële marker is voor ernstige dengue.
Op papier gebaseerde immunoassays zoals lateral flow assays (LFA's) en microfluïdische op papier gebaseerde analytische apparaten (PAD's) hebben aan populariteit gewonnen als diagnostische tests vanwege hun eenvoud, snelheid, goedkoopheid, specificiteit en interpretatiegemak. Conventionele op papier gebaseerde immunoassays voor de detectie van dengue NS1 zijn echter meestal gebaseerd op visuele inspectie, wat alleen kwalitatieve resultaten oplevert. Om deze beperking aan te pakken en de gevoeligheid te verbeteren, hebben we een zeer draagbare NS1-denguedetectietest voorgesteld op een op papier gebaseerd analytisch apparaat (PAD), namelijk DEN-NS1-PAD, dat een smartphone-applicatie integreert als een colorimetrische en kwantitatieve lezer. Het ontwikkelingssysteem maakt directe kwantificering van NS1-concentraties in klinische monsters mogelijk.
Serum- en bloedmonsters van patiënten werden gebruikt om de prestaties van het systeemprototype te demonstreren. De resultaten werden onmiddellijk verkregen en kunnen worden gebruikt voor klinische beoordeling, zowel in goed uitgeruste zorginstellingen als in omgevingen met beperkte middelen. Deze innovatieve combinatie van een op papier gebaseerde immunoassay met een smartphone-applicatie biedt een veelbelovende aanpak voor verbeterde detectie en kwantificering van dengue NS1-antigeen. Door de gevoeligheid te vergroten tot buiten de mogelijkheden van het blote oog, heeft dit systeem een groot potentieel voor het verbeteren van de klinische besluitvorming bij de behandeling van dengue, met name in afgelegen of achtergestelde gebieden.
Introduction
Infectie met het knokkelkoortsvirus (DENV) is de snelst verspreidende door muggen overgedragen ziekte1, en meer dan 390 miljoen mensen zijn besmet met 96 miljoen symptomatische infecties, 2 miljoen gevallen van ernstige ziekte en meer dan 25,000 sterfgevallen per jaar in de wereld 1,2. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) lopen naar schatting 3,9 miljard mensen risico op dengue; ~70% woont in landen in Azië-Pacific en voornamelijk in Zuidoost-Azië3. In 2019 bedroeg het aantal dengue-gevallen dat aan de WHO werd gemeld 4.2 miljoen, en Thailand droeg ten minste 136,000 dengue-gevallen en 144 overlijdensgevallen bij aan dengue-infectie4. De dengue-uitbraak in Thailand vindt plaats tijdens het regenseizoen, van april tot december, in zowel stedelijke als landelijke gebieden, vooral in het noordoostelijke gebied.
DENV-infecties hebben verschillende klinische manifestaties, variërend van subklinische symptomen, milde knokkelkoorts (DF) tot ernstige knokkelkoorts hemorragische koorts (DHF). Het belangrijkste kenmerk van een ernstige DHF-aandoening is een verhoogde vasculaire permeabiliteit, gevolgd door shock en orgaandisfunctie1. Het begrijpen van de moleculaire route die het vasculaire lek kan veroorzaken, is erg belangrijk bij het ontwikkelen van effectieve denguebehandelingen. Dengue niet-structureel eiwit 1 (NS1) is een uitgescheiden glycoproteïne tijdens vroege virusinfectie 5,6 en functioneert als een cofactor voor virale RNA-replicatie7. NS1 kan de afgifte van cytokines veroorzaken en bijdragen aan vasculaire lekkage door zich te binden aan toll-like receptor 4 (TLR4) en endotheliale glycocalyx 8,9. In vitro onderzoek heeft aangetoond dat NS1 interageert met endotheelcellen en apoptose induceert. Deze aandoening kan bijdragen aan endotheeldisfunctie en vasculair lek10. NS1-antigeenspiegels, gecorreleerd met seruminterleukine (IL)-10-spiegels, waren significant verhoogd bij patiënten met ernstige klinischeziekte11. Dengue NS1 draagt ook bij aan de pathogenese van de ziekte door IL-10 te induceren en DENV-specifieke T-celresponsen te onderdrukken12,13. Bovendien was dengue NS1-eiwit gerelateerd aan ernstige klinische ziekte, en de concentratie van NS1 > 600 ng ml-1 in de eerste 3 dagen van de ziekte werd geassocieerd met de ontwikkeling van DHF14.
De persistentie van het dengue NS1-antigeen bij patiënten met DHF kan worden gebruikt als een marker van ernstige dengue6. Er zijn verschillende methoden om NS1 in klinische monsters te detecteren, zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en de snelle test15. De gouden standaard voor het meten van de concentratie van NS1-eiwitten in een klinische setting is de ELISA-methode. De ELISA-methode is echter duur en vereist geschoold personeel en laboratoriumfaciliteiten16. Daarom is de ontwikkeling van technologie voor het detecteren en kwantificeren van NS1-eiwitten in de point-of-care-test (POCT) nog steeds aan de gang. In het afgelopen decennium zijn op papier gebaseerde immunoassays zoals lateral flow assays (LFA's) en microfluïdische op papier gebaseerde analytische apparaten (μPAD's) populair geworden als diagnostische tests vanwege hun eenvoud, snelheid, goedkoopheid en specificiteit 17,18,19. In een op papier gebaseerde immunoassay zijn verschillende labels gebruikt om signalen te genereren, zoals gouden nanodeeltjes (AuNP's)20, magnetische nanodeeltjes21,22, kwantumdots23 en fluorescentiematerialen 24,25. AuNP's zijn de meest voorkomende labels die worden gebruikt in op papier gebaseerde immunoassays vanwege hun lage productiekosten, productiegemak, stabiliteit en eenvoudige uitlezing. Momenteel worden laterale flow-assays (LFA's) voor dengue NS1 beroemd gebruikt in de klinische setting26,27. Conventionele LFA-labeldetectie maakt echter vaak gebruik van het blote oog en levert alleen kwalitatieve resultaten op.
In het afgelopen decennium zijn wereldwijd meer dan 5 miljard smartphones op grote schaal gebruikt en er is potentieel voor de ontwikkeling van draagbare detectie 28,29. Smartphones hebben multifunctionele capaciteiten zoals ingebouwde fysieke sensoren, multi-core processors, digitale camera's, USB-poorten, audiopoorten, draadloze en applicatiesoftware, waardoor ze geschikt zijn voor gebruik in verschillende biosensorplatforms30. Bovendien maken draadloze technologieën het mogelijk om gegevens snel te verzenden en kunnen ze worden gebruikt voor real-time en on-site monitoring31. Mudanyali et al. combineerden de op papier gebaseerde immunoassay en smartphones om een draagbaar, apparatuurvrij, snel, goedkoop en gebruiksvriendelijk POCT-platform voor malaria, tuberculose en HIV32 te ontwikkelen. Ling et al. rapporteerden een laterale flowtest in combinatie met een smartphonecamera om alkalische fosfatase-activiteit in melk kwantitatief te detecteren33. Hou et al. ontwikkelden ook een op smartphones gebaseerd, dual-modality beeldvormingssysteem voor kwantitatieve signalen van kleur of fluorescentie in de laterale flow-assay34. Bovendien kan het gebruik van de smartphone als colorimetrische en kwantitatieve lezer de gevoeligheid verbeteren, terwijl het blote oog de aanwezigheid van het doel niet met vertrouwen kan melden35.
De DEN-NS1-PAD 36,37,38 (hierna het apparaat genoemd) is een doorbraak in de denguediagnostiek en biedt een draagbare en efficiënte oplossing. Met behulp van met was bedrukte microfluïdische technologie op basis van papier, kwantificeert dit apparaat NS1 met hoge gevoeligheid en specificiteit door middel van beeldverwerking. Om de bruikbaarheid verder te vergroten, hebben we een gebruiksvriendelijke smartphone-app ontwikkeld voor colorimetrisch en kwantitatief lezen. Klinische validatie met behulp van patiëntmonsters uit Thaise ziekenhuizen onderstreept de onmiddellijke impact ervan op real-time patiëntbeoordeling. Onze innovatie markeert een cruciale vooruitgang in gestroomlijnd point-of-care-denguebeheer en belooft een revolutie teweeg te brengen in de diagnostiek in zorglandschappen met beperkte middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Ethische Commissie van de Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailand (IRBRTA 1218/2562) heeft goedkeuring verleend. Bij het uitvoeren van dit onderzoek hebben we alle noodzakelijke ethische voorschriften nageleefd.
1. Apparaatfabricage van de op papier gebaseerde immunoassay
OPMERKING: Het op papier gebaseerde immunoassay-apparaat is vervaardigd volgens eerder vastgestelde methoden 36,37 en Thaise patentaanvraag nr. 19010081638.
- Ontwerp en patroontekening: Ontwerp het papieren analyseapparaat (Figuur 1A,B) met 18 PAD-waspatronen op een computer.
OPMERKING: Het ontwerp is specifiek en bedoeld voor papier van A5-formaat. Het aantal PAD's is gerelateerd aan het formaat van het papier, zoals de gebruiker nodig heeft. - Print het ontworpen patroon op het cellulosepapier met behulp van een wasprinter (Table of Materials).
- Smelt het met was bedrukte papier in een laboratoriumoven gedurende 75 s bij 150 °C. Bewaar het vervolgens in een silicadoos totdat u het nodig heeft voor de volgende stappen.
- Breng 0,5 μL 0,025% poly-L-lysine (PLL) aan op zowel de test- als de controlegebieden. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 minuten in een silicabox en verwarm vervolgens gedurende 5 minuten in de oven op 65 °C.
- Breng 0,5 μL van 1 μg μL-1 geitenanti-muis IgG-antilichaam aan op het controlegebied en 0,5 μL van 1 μg μL-1 van het vangantilichaam op het testgebied. Laat de druppels 30 minuten drogen in een silicageldoos op RT.
- Breng 2 μL van de blokkeerbuffer aan op het monstergebied, 3 μL op het geconjugeerde gebied en 2 μL op het detectiegebied. Laat de druppels 30 minuten drogen bij RT in een silicageldoos.
- Breng 2 μL gouden nanodeeltjes-antilichaamcomplex (AuNPs-Ab)-oplossing aan op het geconjugeerde gebied en laat het 30 minuten drogen in een silicageldoos bij RT.
2. Assemblage van de op papier gebaseerde immunoassay
- Verwijder voorzichtig de beschermfolie aan de achterkant van de zelfklevende plastic rugkaart om de lijm bloot te leggen.
- Lijn het behandelde cellulosepapier uit met de zelfklevende plastic rugkaart en druk de twee lagen stevig op elkaar.
NOTITIE: Vermijd het aanraken van het hydrofiele veld om het risico op besmetting of schade aan het apparaat te minimaliseren. - Breng een plastic folie aan om het papier te coaten en druk ze samen.
- Knip het gewenste apparaat met een schaar uit vellen volledig geassembleerde apparaten.
- De DEN-NS1-PAD's (Figuur 1C) zijn nu klaar voor gebruik. Bewaar ze voor langdurige stabiliteit bij 4 °C.
3. Bereiding van het AuNPs-Ab-conjugaat
OPMERKING: De AuNPs-Ab is opgesteld zoals eerder beschreven door Prabowo et al.36.
- Combineer 10 μL van 1 mg ml−1 anti-NS1-antilichaam in PBS, 1 ml 40 nm AuNPs-colloïde en 0,1 ml 0,1 ml boraatbuffer van 0,1 M (pH 8,5).
- Draai het mengsel gedurende 60 minuten op 50 tpm en incubeer bij RT.
- Breng 0,1 ml van 10 mg ml−1 BSA aan in BBS, draai met 50 tpm en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
- Centrifugeer de oplossing bij 20.187 × g en 4 °C gedurende 30 min.
- Pipetteer en scheid het supernatans voorzichtig van de neergeslagen AuNPs-Ab.
- Resuspendeer de AuNPs-Ab in 500 μL BBS en dispergeer het met behulp van sonicatie.
- Herhaal de centrifugatie bij 20.187 × g en 4 °C gedurende 30 min.
OPMERKING: Herhaal de dispersie- en centrifugatieprocessen 3x. - Voeg 50 μL van de geconjugeerde buffer toe aan de suspensie, zodat deze klaar is voor toepassing op het geconjugeerde gebied.
4. Ontwikkeling van mobiele applicaties
- Beeldverwerking en ontwikkeling van machine learning
- Verzamel een dataset voor een beeldmodel onder toezicht door meer dan 900 autofocusbeelden van DEN-NS1-PAD's te verzamelen, waarbij verschillende omstandigheden worden vastgelegd, zoals verschillende concentraties, cameramerken (12-13 megapixels), rotaties (90° en 180°) en verlichtingsinstellingen. Streef naar 30 afbeeldingen onder elke specifieke voorwaarde.
- Label de grondwaarheid door twee interessegebieden te identificeren en te annoteren als de test- en controlegebieden binnen de verzamelde afbeeldingen voor begeleid leren.
- Ontwerp een algoritme om de achtergrondstrook te identificeren. Lokaliseer de middellijn tussen de test- en controlegebieden, bereken het middelpunt en stel een vierkant gebied vast dat evenredig is met de gemiddelde grootte van de twee hoofdgebieden met behoud van dezelfde rotatierichting.
- Maak een afbeeldingssegmentatiemodel met behulp van de gegevensset en grondwaarheidslabels uit stap 4.1.1 en 4.1.2 om een afbeeldingssegmentatiemodel te trainen voor het identificeren van de interessegebieden.
- Applicatie-algoritme
- Pas het getrainde afbeeldingssegmentatiemodel toe op nieuwe afbeeldingen om de test-, besturings- en achtergrondgebieden automatisch te lokaliseren.
- Gebruik basisbeeldverwerkingstechnieken om één intensiteitswaarde te verkrijgen voor elk van de drie interessegebieden (test, controle en achtergrond).
- Transformeer de afbeelding in een 3D-arrayweergave (y, x-kanaal) om toegang te krijgen tot pixelwaarden.
- Converteer de afbeelding naar grijswaarden door het gemiddelde van RGB-waarden te berekenen en inversie toe te passen met de formule (255-x).
- Normaliseer de waarden van het test- en controlegebied door de waarde van het achtergrondgebied af te trekken.
- Gebruik de vooraf vastgestelde kalibratiecurve om de concentratie NS1 te berekenen.
- Classificeer de resultaten als positief of negatief op basis van een afkapwaarde van 0,1103 afgeleid van de genormaliseerde grijswaardenintensiteiten37.
5. Kalibratiecurve en gevoeligheden
- Bereid het NS1-monster voor in menselijk serum voor kalibratie met concentraties van 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 en 1,0 μg ml-1.
- Breng 50 μl van elke concentratie aan op het monstergebied en voer de metingen in drievoud uit.
- Laat de monsters volledig in het apparaat trekken, wat 20-30 minuten kan duren om resultaten te verkrijgen.
- Maak beelden van het apparaat met een digitale camera of smartphone na 5 minuten incubatie.
- Analyseer de test- en controlegebieden met behulp van ImageJ en een aangepaste mobiele applicatie.
- Construeer de kalibratiecurve op basis van gegevens van ImageJ en de mobiele applicatie.
- Bereken de limiet van blanco (LOB), de detectielimiet (LOD) en de limiet van kwantificering (LOQ) met behulp van onderstaande vergelijkingen (1-3):
LOB = Gemiddelde van de blancogegevens + 1:645* ð (standaarddeviatie van blancogegevens) (1)
LOD = LOB +1:645*ð (standaarddeviatie van de laagste concentratiegegevens) (2)
LOQ = Gemiddelde van blanco gegevens + 10*ð (standaarddeviatie van blanco gegevens) (3)
6. Het uitvoeren van een op papier gebaseerde immunoassay met klinische monsters
- Verzamel en verwerk 300 μL perifeer bloed van 30 patiënten op de eerste dag van ziekenhuisopname in paarse EDTA-buisjes, volgens goede klinische praktijken.
- Centrifugeer het bloed bij 2.884 × g en 4 °C gedurende 20 min.
- Breng de vloeibare component (plasma) met behulp van een pipet over in een schoon polypropyleen buisje.
- Bewaar het plasma onmiddellijk in de vriezer bij −20 °C voor verdere analyse.
- Breng 20 μL plasma aan op het monstergebied bovenop het apparaat. Voeg vervolgens 30 μL wasbuffer toe (0,05% v/v Tween 20 in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing).
- Laat het monster volledig in het apparaat trekken, wat 20-30 minuten kan duren om de resultaten te verkrijgen.
- Maak beelden van het apparaat met een digitale camera of smartphone na 5 minuten incubatie bij kamertemperatuur.
- Analyseer de test- en controlegebieden met behulp van ImageJ en een aangepaste mobiele applicatie.
7. Kwantificering met mobiele applicatie
OPMERKING: De intensiteit van de op papier gebaseerde immunoassay wordt geanalyseerd in de mobiele applicatie (Figuur 2).
- Open de ontwikkelde mobiele applicatie op de smartphone.
- Selecteer Camera gebruiken of Uploaden vanuit galerij om de gegevensbron te kiezen of te uploaden. Doe dit door middel van camera-opname of door een afbeelding uit de galerij van het apparaat te selecteren.
- Navigeer naar het analytische gedeelte en tik op de knop Analyseren op het scherm.
- Wacht tot de toepassing de gegevens analyseert en de resultaten weergeeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het selecteren van een fabricagemethode is van cruciaal belang om reproduceerbare testprestaties te garanderen in op papier gebaseerde immunoassay-apparaten. In onze studie onderzochten we verschillende productieprocessen en materialen in de context van het demonstreren van een op papier gebaseerde immunoassay. Onze gekozen methode maakt gebruik van een wasprintsysteem om hydrofobe barrières te creëren in op papier gebaseerde microfluïdische apparaten. Deze aanpak onderscheidt zich door zijn eenvoud, snelheid en consistente resultaten. Merk op dat het het voordeel biedt dat het gebruik van fotoresistchemicaliën wordt vermeden, die de eiwitadsorptie kunnen verstoren en de hydrofobiciteit van cellulosepapier kunnen verhogen. Bovendien zorgt wasprinten voor consistente afmetingen van fluïdische kanalen, wat bijdraagt aan herhaalbare testprestaties.
Na de vorming van hydrofobe barrières werden de nodige reagentia voor de immunoassay aangebracht op het oppervlak van het cellulosepapier. Met elektrostatische adsorptie hielp PLL bij immobilisatie van biomoleculen door interactie met zowel de positieve lading van aminefunctionele groepen als het negatief geladen antilichaam. Deze stap vergemakkelijkt de modificatie en immobilisatie van antilichamen en de toepassing van label-antilichaamconjugaten tijdens de fabricageprocessen. Belangrijk is dat deze stap parallel kan worden uitgevoerd. De assemblage van de papieren immunoassay-apparaten (DEN-NS1-PAD, zoals weergegeven in figuur 1A) wordt voltooid door het gemodificeerde papier op een zelfklevende plastic rugkaart te stapelen en te lamineren met een plastic folie.
Het belangrijkste doel van dit onderzoek is het ontwikkelen van een gebruiksvriendelijke methode met behulp van een smartphone om NS1-concentraties te meten. Deze aanpak kan worden gebruikt als een point-of-care testing (POCT)-apparaat in zowel thuis- als klinische omgevingen. Gezien het brede scala aan NS1-concentraties in het serum van de patiënt, werden eenvoudige lineaire modellen gebruikt op basis van de resultaten van deze experimenten. Voor elke NS1-concentratie werd een dataset van drie testapparaten opgesteld. Foto's van de apparaten werden gemaakt met een smartphone onder standaardinstellingen en optimale lichtomstandigheden, waardoor een donkere doos niet meer nodig was. De testzone van de PAD's bevat dengue NS1 monoklonaal antilichaam van muizen, terwijl de controlezone geit anti-muis IgG-antilichaam bevat. Met een sandwich-assay-formaat komen hogere NS1-concentraties in monsters overeen met een verhoogde intensiteit van de rode kleur in de testzone. Daarentegen blijft de kleurintensiteit in de controlezone relatief constant. Figuur 1B toont onbewerkte smartphonebeelden, die een voordelige visuele waarneming bieden zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is.
Met behulp van een speciale mobiele applicatie hebben we de intensiteiten genormaliseerd en eenvoudige lineaire modellen berekend voor piekende NS1-concentraties in serummonsters - de coëfficiëntcorrelatie (r2) verkregen uit de mobiele applicatie. De correlatie van de coëfficiënt (r2) verkregen uit de mobiele applicatie was 0,92 (figuur 3), in lijn met de verwachtingen. Deze op smartphones gebaseerde benadering presteerde beter dan observatie met het blote oog en verbeterde de gevoeligheid aanzienlijk met 178%. Bovendien werden de limiet van blanco (LoB), detectielimiet (LoD) en limiet van kwantificering (LoQ) berekend voor de genormaliseerde intensiteiten, zoals weergegeven in tabel 1.
Klinische monsters uit de echte wereld werden gebruikt om de praktische functionaliteit van DEN-NS1-PAD's in klinische omgevingen te demonstreren. De op papier gebaseerde immunoassay produceerde kwalitatieve kleuruitlezingen binnen 20-30 minuten, waardoor visuele bepaling van negatieve of positieve uitkomsten mogelijk was. Serummonsters van patiënten die verdacht werden van dengue werden aan het apparaat onderworpen. Figuur 4 illustreert en vergelijkt de resultaten van zowel het hulpmiddel als een commerciële snelle diagnostische test (RDT). Tabel 2 geeft een overzicht van de resultaten van visuele metingen en het op smartphones gebaseerde systeem. De commerciële RDT en het apparaat leverden vergelijkbare resultaten op, met zeven positieve en 23 negatieve resultaten van visueel lezen. Daarentegen rapporteerde het op smartphones gebaseerde lezersysteem dat exclusief op het apparaat werd toegepast, negen positieve en 21 negatieve uitkomsten van klinische monsters.
Figuur 1: Afbeeldingen van ontworpen en gefabriceerde DEN-NS1-PAD. (A,B) Een enkel kanaal van de hydrofobe barrière met waspatroon wordt ontworpen en afgebeeld in drie toestanden (C) vóór en (D,E) na het inbrengen van de monsteroplossing in het aangewezen gebied en het tonen van respectievelijk de (D) negatieve en (E) positieve resultaten. De monsteroplossing stroomt door het kanaal (zie gelabelde pijl) en interageert met de componenten op belangrijke locaties - AuNP's-Ab in het geconjugeerde gebied, anti-NS1-antilichaam in het testgebied (indicatief voor een positief dengue NS1-resultaat) en anti-muis IgG in het controlegebied. De resultaten zijn gemakkelijk waarneembaar met het blote oog en kunnen worden gekwantificeerd door beeldverwerking met behulp van een flatbedscanner of smartphonecamera. Afkorting: AuNPs-Ab = gouden nanodeeltjes-antilichaamconjugaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Screenshots van het scherm van de telefoon vanuit de mobiele app. (A) Gebruikersscherm van de Android-applicatie die op de mobiele telefoon wordt uitgevoerd, (B) weergave van het applicatiescherm, (C) hoofdmenu van de applicatie dat de gebruikers kunnen selecteren om de camera te gebruiken of een afbeelding uit de galerij te uploaden, (D) weergave van een gerelateerde afbeelding om te testen, (E) weergave van de afteltijd om te analyseren, F) weergave van de testresultaten, met inbegrip van de intensiteit van de test- en controlezone, de beslissing van infectie (positief/negatief) en de concentratie van NS1 in het monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Lineaire kalibratiecurve voor NS1-detectie in serum. Het apparaat werd gebruikt en beelden werden geïnterpreteerd door verwerking via een applicatie op basis van smartphonegegevens. De foutbalken tonen ±1 standaarddeviatie, n = 3. Afkortingen: T = testgebied; C = controlegebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Afbeelding van DEN-NS1-PAD uit de klinische steekproeftest. Serum (50 μL) werd gebruikt in een op papier gebaseerde immunoassay. (A) Voorbeeld van een negatief resultaat, (B) positieve resultaten, (C) algemene resultaten en vergelijking van RDT versus immunoassay op papier. Afkortingen: RDT = Rapid Diagnostic test; Pos = positief; Neg = negatief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Parameter | Blote ogen | Mobiele app |
| Limiet van blanco (LoB) | - | 43.15 ng ml-1 |
| Detectielimiet (LoD) | 200 ng ml-1 | 112.19 ng ml-1 |
| Limiet van kwantificering (LoQ) | - | 373.58 ng ml-1 |
Tabel 1: LoB, LoD en LoQ van ImageJ en mobiele applicatie op gegevenskalibratiestandaard NS1 in serum. Afkortingen: LoB = limiet van blanco; LoD = detectiegrens; LoQ = kwantificeringsgrens.
| Patiënt nr. | Blote ogen | Smartphone-app | AfbeeldingJ | |
| RDT | Immunoassay op papier | |||
| 1 | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - |
| 3 | - | - | - | - |
| 4 | - | - | - | - |
| 5 | - | - | - | - |
| 6 | - | - | - | - |
| 7 | - | - | - | - |
| 8 | - | - | - | - |
| 9 | + | + | + | + |
| 10 | - | - | + | + |
| 11 | - | - | - | - |
| 12 | + | + | + | + |
| 13 | - | - | - | - |
| 14 | - | - | - | - |
| 15 | - | - | - | - |
| 16 | + | + | + | + |
| 17 | + | + | + | + |
| 18 | - | - | - | - |
| 19 | - | - | - | - |
| 20 | - | - | - | - |
| 21 | + | + | + | + |
| 22 | + | + | + | + |
| 23 | - | - | - | - |
| 24 | + | + | + | + |
| 25 | - | - | - | - |
| 26 | - | - | - | - |
| 27 | - | - | - | - |
| 28 | - | - | - | - |
| 29 | - | - | - | - |
| 30 | - | - | + | + |
Tabel 2: Vergelijking van de resultaten van visueel lezen en smartphone-gebaseerde lezersystemen voor serummonsters. (+) en (-) duiden respectievelijk op positieve en negatieve interpretaties van de resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een van de belangrijke ontwerpparameters voor een op smartphones gebaseerd lezersysteem is de mogelijkheid om reproduceerbare beeldverwerking van monsters te bieden. In dit onderzoek werden voor de eenvoud en het gemak de beelden gemaakt van drie verschillende smartphonemerken met 12-13 MP-camera's zonder gebruik te maken van een beelddoos of accessoires. Variabele omstandigheden voor het vastleggen van afbeeldingen, zoals de resolutie van de camera, de opnametijd van het beeld, de lichtomstandigheden en de omgeving, kunnen de kleurintensiteit van de test- en controlepunten op het apparaat beïnvloeden. De impact van verschillende beeldopnametijden op de verlichting en droging van PAD op de signaalintensiteiten van de apparaten werd geminimaliseerd door gebruik te maken van de genormaliseerde signaalintensiteiten, die consistent bleven tussen beelden die op verschillende tijdstippen werden vastgelegd36. Het aftrekken van achtergrondsignalen kwam naar voren als een strategie om de nauwkeurigheid van kleurintensiteitsmetingen te verbeteren, waardoor de invloed van lichtomstandigheden effectief werd verminderd. Onze bevinding komt overeen met eerder onderzoek dat de werkzaamheid van basislijn- of achtergrondaftrektechnieken benadrukt bij het minimaliseren van milieueffecten39,40.
Het voortdurende debat over de superioriteit van het gebruik van een beelddoos of een accessoirevrije methode heeft implicaties voor de beeldverwerking39,41. Een beeldvormingsdoos kan de robuustheid van beeldverwerkingsresultaten verbeteren door variaties in beeldvormingsomstandigheden te minimaliseren 41,42,43. In dit onderzoek hebben we een mobiele applicatie op basis van cloud machine learning gebruikt voor beeldverwerking. Deze aanpak maakt gebruik van machine learning binnen een cloudgebaseerd platform om afbeeldingsgegevens automatisch te classificeren, extraheren en verrijken. De applicatie identificeerde en verwerkte effectief het interessegebied in afbeeldingen, inclusief de achtergrond-, test- en controlezones. Deze stap was cruciaal om onderscheid te maken tussen deze zones38. Eerder onderzoek suggereert dat beeldverwerking met behulp van machine learning een superieure classificatie oplevert tussen uitkomsten voor controle- en testmonsters 43,44,45. In deze studie genereerde het gebruik van de vaste locatie en achtergrondaftrekking een consistent achtergrondsignaal van de cellulose μPAD's, waardoor de consistentie en classificatienauwkeurigheid van de metingen van de mobiele applicatie40,43 werd verbeterd.
Wat betreft de consistente prestaties bij het demonstreren van een op papier gebaseerde immunoassay, speelt de fabricagemethode een belangrijke rol. In een eerdere studie36 werden verschillende optimalisatievoorwaarden voor de ontwerp- en fabricagemethode van DEN-NS1-PAD, zoals concentraties van PLL, blokkerende stof en NS1-antilichaam, bestudeerd. Het apparaat testte NS1 met succes in buffer, celkweek en humaan serum, zowel kwalitatief als kwantitatief.
Matrixeffecten die afkomstig zijn van serumcomponenten kunnen de detectielimiet van het apparaat verstoren bij het testen van serummonsters. De resultaten geven echter aan dat de ontwikkelde immunoassay met succes NS1-concentraties in serummonsters kon detecteren, wat resultaten opleverde die vergelijkbaar waren met die van de commerciële RDT (tabel 2). De zichtbare resultaten met behulp van visuele inspectie en de mobiele applicatie (Figuur 4) werden waargenomen, wat de effectiviteit van de test voor serumtesten onderstreept. Hoewel de hogere viscositeit van serum van invloed kan zijn op de analysetijden, belemmert dit de interpretatie van de resultaten niet36. Het gebruik van een mobiele applicatie kan positievere resultaten opleveren voor monstertests, omdat het gebruik van een mobiele applicatie de gevoeligheid van monstertests aanzienlijk verbetert46. Het is vermeldenswaard dat verdere vergelijkingen met moleculaire tests zoals RT-PCR 15,47,48 voor dengue NS1 nodig zijn om mogelijke vals-positieve of vals-negatieve resultaten te bepalen.
Een opmerkelijke beperking van deze studie doet zich voor bij het overwegen van een complexere monstermatrix zoals bloed. De componenten die in het bloed aanwezig zijn, kunnen inderdaad de detectielimiet van het apparaat verstoren. In dergelijke gevallen is het gebruik van extra absorberende pads om de absorptie van de lopende buffer te verbeteren een mogelijke oplossing. Deze modificatie kan de bloedstolling bevorderen, gebruikmakend van de hemostyptische eigenschappen van cellulose door bloedplaatjes te beïnvloeden49. Een andere benadering is het aanbrengen van 4% (w/v) zoutoplossing druppels op het monsterkussen om de bloedstolling te verbeteren. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat zouten zoals calciumchloride en natriumchloride de stolling van rode bloedcellen (RBC) induceren50,51. Na+ kan de suspensie van rode bloedcellen in het bloed destabiliseren door de elektrische dubbele laag op het rode bloedoppervlak te onderdrukken en de afstoting van lading tussen rode bloedcellen te verminderen. Bovendien induceert een hoge zoutconcentratie ook bloedaggregatie52. Bovendien onderdrukt de contra-ionvalentielading van de Na+ de dikte van de geladen dubbele laag RBC's, wat leidt tot de aggregatie van de leeggelopen RBC's. De toevoeging van 4% (m/v) zoutoplossing (NaCl) vergemakkelijkt de plasmascheiding op cellulosepapier51. Een zorgvuldige optimalisatie van de zoutconcentratie is echter noodzakelijk om ongewenste effecten op de bloedaggregatie en de aggregatie van goudnanodeeltjes te voorkomen53,54.
Commerciële waxprinters boden een ideale combinatie van kosten en eenvoud van prototyping. Aangezien deze printers in 2016 werden stopgezet, waren alternatieve fabricagemethoden nodig, zoals inkjetprinten55, zeefdruk56 en fotolithografie57. Een tonerprinter voor op kantoor is een goede kandidaat voor de fabricage van μPAD. De polyesterhars in de toner creëert hydrofobe patronen bij 200 °C gedurende 60 minuten met verschillende ontwerpen58.
Antilichaam NS1 serotype twee, zoals gespecificeerd door het bedrijf, werd in dit onderzoek gebruikt. We ontdekten echter dat dit antilichaam ook interageert met alle serotypen36,37. De gevoeligheden voor detectie van DENV-4 zijn lager (87,5%) in vergelijking met andere serotypen. De gevoeligheid van DENV-1 en DENV-2 is ongeveer 88,89% en voor DENV-3 100%37. Deze bevindingen komen overeen met eerder onderzoek, dat ook een lagere gevoeligheid van RDT voor DENV-4 rapporteerde in vergelijking met andere serotypen59. De algehele gevoeligheid van het apparaat is ~88,89%, met een specificiteit van ongeveer 86,67%. Het is opmerkelijk dat de werkelijke gevoeligheid van DEN-NS1-PAD die van commerciële RDT kan overtreffen. RDT vertoont echter een positief voorspellende waarde (PPV) van 84,62% en een nauwkeurigheid van 87,67%. Met name de DEN-NS1-PAD presteerde beter bij het detecteren van dengue-infectie in de eerste 5-6 dagen, terwijl RDT alleen effectief is in de eerste 5 dagen37.
Samenvattend is het combineren van een draagbare op papier gebaseerde immunoassay (DEN-NS1-PAD) met een smartphone-applicatie veelbelovend voor dengue NS1-metingen. De mobiele applicatie verbetert de gevoeligheid en efficiëntie aanzienlijk bij het kwantificeren van NS1 in serummonsters in vergelijking met observatie met het blote oog. De voordelen van de mobiele applicatie zijn onder meer een kortere analysetijd, gebruiksvriendelijkheid en compatibiliteit met verschillende smartphone-apparaten, posities en lichtomstandigheden. Er is echter verdere verbetering nodig om de gevoeligheid en prestaties te verbeteren. Ondertussen is aanpassing van de op papier gebaseerde immunoassay noodzakelijk om de prestaties ervan bij het omgaan met bloedmonsters te verbeteren. Verder zijn uitgebreide evaluaties vereist van de DEN-NS1-PAD voor het detecteren van dengue met behulp van een groter aantal primaire infectieserotypen en geselecteerde monsters verzameld bij verschillende patiënten (kinderen en volwassenen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
M.H.P. is dankbaar voor het onderzoeksfonds van de Universitas Islam Indonesia (UII). De auteurs betuigen hun dankbaarheid aan de heer Nutchanon Ninyawee voor zijn waardevolle expertise en hulp tijdens de ontwikkeling van de mobiele applicatie en zijn bijdragen aan het manuscript. Verder waarderen de auteurs de financiële steun van Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (projectnr. FRB660073/0164) in het kader van het programma Smart Healthcare van King Mongkut's University of Technology Thonburi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10x30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
- Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
- World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
- WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
- Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
- Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
- Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
- Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
- Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
- Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
- Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
- Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
- Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
- Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
- World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
- Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
- Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
- Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
- Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V.
- Hu, J., et al.
- Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
- Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
- Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
- He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
- Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
- Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
- Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
- Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D.
- Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
- Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
- Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
- Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
- Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
- You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
- Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
- Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
- Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. Prabowo, M. H., et al. , 1901000816 (2019).
- Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
- Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
- Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
- Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
- Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
- Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
- Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
- Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
- Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
- Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
- Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
- Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
- Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
- Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
- Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
- Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
- Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
- Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
- Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).
