Summary
For at imødekomme presserende denguefeberdiagnostiske behov introducerer vi her en smartphone-app-integreret Dengue NS1 papirbaseret analytisk enhed (DEN-NS1-PAD) til kvantificering af Dengue NS1-antigenkoncentration i klinisk serum / blodprøver. Denne innovation forbedrer denguefeberstyring ved at hjælpe klinisk beslutningstagning i forskellige sundhedsindstillinger, selv ressourcebegrænsede.
Abstract
Dengue-virus (DENV) infektion, som overføres af Aedes myg, er et stort folkesundhedsproblem i tropiske og subtropiske lande. Med en årlig forekomst på ca. 10 millioner tilfælde og 20.000-25.000 dødsfald, især blandt børn, er der et presserende behov for praktiske diagnostiske værktøjer. Tilstedeværelsen af dengue non-strukturelle protein 1 (NS1) under tidlig infektion har været forbundet med cytokinfrigivelse, vaskulær lækage og endoteldysfunktion, hvilket gør det til en potentiel markør for svær denguefeber.
Papirbaserede immunoassays såsom laterale flowassays (LFA'er) og mikrofluidiske papirbaserede analytiske enheder (PAD'er) har vundet popularitet som diagnostiske tests på grund af deres enkelhed, hurtighed, billighed, specificitet og lette fortolkning. Imidlertid er konventionelle papirbaserede immunoassays til dengue NS1-detektion typisk afhængige af visuel inspektion, hvilket kun giver kvalitative resultater. For at imødegå denne begrænsning og øge følsomheden foreslog vi et meget bærbart NS1 dengue-detektionsassay på en papirbaseret analytisk enhed (PAD), nemlig DEN-NS1-PAD, der integrerer en smartphone-applikation som en kolorimetrisk og kvantitativ læser. Udviklingssystemet muliggør direkte kvantificering af NS1-koncentrationer i kliniske prøver.
Serum- og blodprøver opnået fra patienter blev brugt til at demonstrere systemets prototype ydeevne. Resultaterne blev opnået med det samme og kan anvendes til klinisk vurdering, både i veludstyrede sundhedsfaciliteter og ressourcebegrænsede omgivelser. Denne innovative kombination af et papirbaseret immunassay med en smartphone-applikation tilbyder en lovende tilgang til forbedret detektion og kvantificering af dengue NS1-antigen. Ved at øge følsomheden ud over det blotte øjes muligheder har dette system et stort potentiale for at forbedre klinisk beslutningstagning i denguefeberhåndtering, især i fjerntliggende eller underbetjente områder.
Introduction
Dengue-virus (DENV) infektion er den hurtigst spredende myggebårne sygdom1, og mere end 390 millioner mennesker er inficeret med 96 millioner symptomatiske infektioner, 2 millioner tilfælde af alvorlig sygdom og mere end 25.000 dødsfald om året forekommer i verden 1,2. Ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO) er anslået 3,9 milliarder mennesker i fare for denguefeber; ~ 70% bor i Asien og Stillehavsområdet og hovedsageligt i Sydøstasien3. I 2019 var antallet af dengue-tilfælde rapporteret til WHO 4,2 millioner, og Thailand bidrog med mindst 136,000 dengue-tilfælde og 144 dødsfald fra dengue-infektion4. Dengue-udbruddet i Thailand forekommer i regntiden, fra april til december, i både byområder og landdistrikter, især i det nordøstlige område.
DENV-infektioner har forskellige kliniske manifestationer lige fra subkliniske symptomer, mild denguefeber (DF) til svær dengue hæmoragisk feber (DHF). Hovedkarakteristikken ved svær DHF-tilstand er øget vaskulær permeabilitet efterfulgt af chok og organdysfunktion1. Forståelse af den molekylære vej, der kan forårsage vaskulær lækage, er meget vigtig for at udvikle effektive dengue-behandlinger. Dengue non-structural protein 1 (NS1) er et udskilt glycoprotein under tidlig virusinfektion 5,6, og det fungerer som en cofaktor for viral RNA-replikation7. NS1 kan udløse cytokinfrigivelse og bidrage til vaskulær lækage ved binding til toll-lignende receptor 4 (TLR4) og endotelglycocalyx 8,9. In vitro forskning har vist, at NS1 interagerer med endotelceller og inducerer apoptose. Denne tilstand kan bidrage til endoteldysfunktion og vaskulær lækage10. NS1 antigen niveauer, korreleret med serum Interleukin (IL)-10 niveauer, blev øget signifikant hos patienter med svær klinisk sygdom11. Dengue NS1 bidrager også til sygdomspatogenese ved at inducere IL-10 og undertrykke DENV-specifikke T-celleresponser12,13. Derudover var dengue NS1-protein relateret til alvorlig klinisk sygdom, og koncentrationen af NS1 > 600 ng ml-1 i de første 3 dage af sygdommen var forbundet med udviklingen af DHF14.
Persistensen af dengue NS1-antigenet hos patienter med DHF kan anvendes som markør for svær dengue6. Der findes flere metoder til påvisning af NS1 i kliniske prøver, såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) og hurtigtesten15. Guldstandarden til måling af koncentrationen af NS1-proteiner i kliniske omgivelser er ELISA-metoden. ELISA-metoden er imidlertid dyr og kræver kvalificeret personale og laboratoriefaciliteter16. Derfor er udviklingen af teknologi til påvisning og kvantificering af NS1-proteiner i point-of-care testen (POCT) stadig i gang. I det sidste årti er papirbaserede immunoassays såsom laterale flowassays (LFA'er) og mikrofluidiske papirbaserede analytiske enheder (μPAD'er) blevet populære som diagnostiske tests på grund af deres enkelhed, hurtighed, billighed og specificitet 17,18,19. I et papirbaseret immunassay er flere etiketter blevet brugt til at generere signaler, såsom guldnanopartikler (AuNP'er)20, magnetiske nanopartikler21,22, kvantepunkter23 og fluorescensmaterialer24,25. AuNP'er er de mest almindelige etiketter, der anvendes i papirbaserede immunoassays på grund af deres billige produktionsomkostninger, brugervenlighed, stabilitet og enkel udlæsning. I øjeblikket anvendes laterale flowassays (LFA'er) til dengue NS1 berømt i den kliniske indstilling26,27. Imidlertid bruger konventionel LFA-etiketdetektion almindeligvis det blotte øje og giver kun kvalitative resultater.
I det sidste årti er mere end 5 milliarder smartphones blevet brugt i vid udstrækning globalt, og der er potentiale for at udvikle bærbar detektion28,29. Smartphones har multifunktionelle kapaciteter såsom indbyggede fysiske sensorer, multi-core processorer, digitale kameraer, USB-porte, lydporte, trådløs og applikationssoftware, hvilket gør dem velegnede til brug i forskellige biosensorplatforme30. Desuden gør trådløse teknologier det muligt at sende data hurtigt og kan anvendes til overvågning i realtid og på stedet31. Mudanyali et al. kombinerede det papirbaserede immunassay og smartphones for at udvikle en bærbar, udstyrsfri, hurtig, billig og brugervenlig POCT-platform til malaria, tuberkulose og HIV32. Ling et al. rapporterede et lateralt flowassay kombineret med et smartphone-kamera til kvantitativ påvisning af alkalisk fosfataseaktivitet i mælk33. Hou et al. udviklede også et smartphone-baseret, dual-modality billeddannelsessystem til kvantitative signaler fra farve eller fluorescens i lateral flow assay34. Derudover kan brug af smartphone som kolorimetrisk og kvantitativ læser forbedre følsomheden, mens det blotte øje ikke med sikkerhed kan rapportere tilstedeværelsen af målet35.
DEN-NS1-PAD 36,37,38 (herefter kaldet enheden) præsenterer et gennembrud inden for dengue-diagnostik og tilbyder en bærbar og effektiv løsning. Ved hjælp af vokstrykt mikrofluidisk papirbaseret teknologi kvantificerer denne enhed NS1 med høj følsomhed og specificitet gennem billedbehandling. For yderligere at forbedre dens anvendelighed har vi udviklet en brugervenlig smartphone-app til kolorimetrisk og kvantitativ aflæsning. Klinisk validering ved hjælp af patientprøver fra thailandske hospitaler understreger dens umiddelbare indvirkning på patientvurdering i realtid. Vores innovation markerer et afgørende fremskridt inden for strømlinet point-of-care-denguefeberstyring, der lover at revolutionere diagnostik i ressourcebegrænsede sundhedslandskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den etiske komité under Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailand (IRBRTA 1218/2562) gav godkendelse. Ved gennemførelsen af denne undersøgelse overholdt vi alle nødvendige etiske bestemmelser.
1. Enhedsfremstilling af det papirbaserede immunoassay
BEMÆRK: Den papirbaserede immunoassay-enhed blev fremstillet efter tidligere etablerede metoder36,37 og thailandsk patentanmodning nr. 19010081638.
- Design og mønstertegning: Design papiranalyseenheden (figur 1A, B) med 18 PAD-voksmønstre på en computer.
BEMÆRK: Designet er specifikt og beregnet til papir i A5-størrelse. Antallet af PAD'er er relateret til papirets størrelse, som brugeren kræver. - Udskriv det designede mønster på cellulosepapiret ved hjælp af en voksprinter (materialetabel).
- Smelt det vokstrykte papir i en laboratorieovn i 75 s ved 150 °C. Opbevar det derefter i en silicakasse, indtil det er nødvendigt for de efterfølgende trin.
- Påfør 0,5 μL 0,025% poly-L-lysin (PLL) på både test- og kontrolområderne. Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 2 minutter i en silicakasse og opvarm derefter i ovnen ved 65 °C i 5 min.
- Der påføres 0,5 μL 1 μg μL-1 IgG-antistof mod gedeantimus på kontrolområdet og 0,5 μL 1 μg μL-1 af indfangningsantistoffet på testområdet. Lad dråberne tørre i en silicagelæske ved RT i 30 minutter.
- Der påføres 2 μL blokerende buffer på prøveområdet, 3 μL på det konjugerede område og 2 μL på detektionsområdet. Lad dråberne tørre ved RT i en silicagelkasse i 30 min.
- Påfør 2 μL guldnanopartikel-antistofkompleks (AuNPs-Ab) opløsning på konjugatområdet og lad det tørre i en silicagelkasse ved RT i 30 minutter.
2. Samling af det papirbaserede immunoassay
- Fjern forsigtigt beskyttelsesfilmen på bagsiden af det klæbende plastbagside for at blotlægge klæbemidlet.
- Juster det behandlede cellulosepapir med det klæbende plastbagsidekort, og tryk de to lag godt sammen.
BEMÆRK: Undgå at røre ved det hydrofile felt for at minimere risikoen for kontaminering eller beskadigelse af enheden. - Påfør en plastfilm for at belægge papiret og tryk dem sammen.
- Klip det ønskede stykke enheder ved hjælp af en saks fra ark med fuldstændigt monterede enheder.
- DEN-NS1-PAD'erne (figur 1C) er nu klar til brug. For langsigtet stabilitet opbevares de ved 4 °C.
3. Forberedelse af AuNPs-Ab-konjugatet
BEMÆRK: AuNPs-Ab blev udarbejdet som tidligere beskrevet af Prabowo et al.36.
- Kombiner 10 μL 1 mg ml-1 anti-NS1-antistof i PBS, 1 ml 40 nm AuNPs kolloid og 0,1 ml 0,1 M boratbuffer (pH 8,5).
- Blandingen roteres ved 50 rpm i 60 min og inkuberes ved RT.
- Påfør 0,1 ml 10 mg ml-1 BSA i BBS, roter ved 50 rpm og inkuber ved RT i 15 min.
- Opløsningen centrifugeres ved 20,187 × g og 4 °C i 30 minutter.
- Supernatanten afpipetteres forsigtigt og adskilles fra den udfældede AuNPs-Ab.
- Resuspender AuNPs-Ab i 500 μL BBS og spred det ved hjælp af sonikering.
- Centrifugeringen gentages ved 20,187 × g og 4 °C i 30 minutter.
BEMÆRK: Gentag dispersions- og centrifugeringsprocesserne 3x. - Der tilsættes 50 μL af den konjugerede buffer til suspensionen, så den er klar til påføring på det konjugerede område.
4. Udvikling af mobilapplikationer
- Udvikling af billedbehandling og maskinel indlæring
- Indsaml et datasæt til en overvåget billedmodel ved at indsamle over 900 automatisk fokuserende billeder af DEN-NS1-PAD'er, fange forskellige forhold, f.eks. forskellige koncentrationer, kameramærker (12-13 megapixel), rotationer (90° og 180°) og lysindstillinger. Sigt efter 30 billeder under hver specifik betingelse.
- Mærk grundsandheden ved at identificere og kommentere to interesseområder som test- og kontrolområder inden for de indsamlede billeder til overvåget læring.
- Design en algoritme til at identificere baggrundsstrimlen. Find midterlinjen mellem test- og kontrolregionerne, beregn dens midtpunkt, og etabler et kvadratisk område, der er proportionalt med gennemsnitsstørrelsen af de to hovedregioner, samtidig med at den samme rotationsretning opretholdes.
- Opret en billedsegmenteringsmodel ved hjælp af datasættets og de grundlæggende sandhedsmærkater fra trin 4.1.1 og 4.1.2 for at træne en billedsegmenteringsmodel til identifikation af interesseområder.
- Applikationsalgoritme
- Anvend den trænede billedsegmenteringsmodel på nye billeder for automatisk at finde test-, kontrol- og baggrundsområderne.
- Brug grundlæggende billedbehandlingsteknikker til at opnå en enkelt intensitetsværdi for hvert af de tre interesseområder (test, kontrol og baggrund).
- Omdan billedet til en 3D-array-repræsentation (y, x-kanal) for at få adgang til pixelværdier.
- Konverter billedet til gråtoner ved at beregne gennemsnittet af RGB-værdier, og anvend invertering med formlen (255-x).
- Normaliser værdierne for test- og kontrolområdet ved at trække baggrundsområdeværdien.
- Brug den forudindstillede kalibreringskurve til at beregne koncentrationen af NS1.
- Klassificer resultaterne som positive eller negative baseret på en afskæringsværdi på 0,1103 afledt af de normaliserede gråtoneintensiteter37.
5. Kalibreringskurve og følsomhed
- Forbered NS1-prøve i humant serum til kalibrering med koncentrationer på 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 og 1,0 μg ml-1.
- 50 μL af hver koncentration hældes på prøveområdet, og målingerne udføres i tre eksemplarer.
- Lad prøverne væge helt ind i enheden, hvilket kan tage 20-30 minutter at opnå resultater.
- Tag billeder af enheden ved hjælp af et digitalkamera eller en smartphone efter 5 minutters inkubation.
- Analysér test- og kontrolområderne ved hjælp af ImageJ og en brugerdefineret mobilapplikation.
- Konstruer kalibreringskurven baseret på data fra ImageJ og mobilapplikationen.
- Beregn blindprøvegrænsen (LOB), detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (LOQ) ved hjælp af ligningerne (1-3) nedenfor:
LOB = gennemsnit af de tomme data + 1:645* ð (blinddatas standardafvigelse) (1)
LOD = LOB +1:645*ð (standardafvigelse for de laveste koncentrationsdata) (2)
LOQ = gennemsnit af tomme data + 10*ð (blinddatas standardafvigelse) (3)
6. Udførelse af et papirbaseret immunoassay med kliniske prøver
- Opsaml og behandl 300 μL perifert blod fra 30 patienter på den første indlæggelsesdag i lilla EDTA-rør efter god klinisk praksis.
- Blodet centrifugeres ved 2.884 × g og 4 °C i 20 minutter.
- Overfør den flydende komponent (plasma) til et rent polypropylenrør ved hjælp af en pipette.
- Plasmaet opbevares straks i fryseren ved -20 °C til efterfølgende analyse.
- Påfør 20 μL plasma på prøveområdet oven på enheden. Derefter tilsættes 30 μL vaskebuffer (0,05% v/v Tween 20 i 1x fosfatbufret saltvand).
- Lad prøven væge helt ind i enheden, hvilket kan tage 20-30 minutter at opnå resultaterne.
- Tag billeder af enheden ved hjælp af et digitalkamera eller en smartphone efter 5 minutters inkubation ved stuetemperatur.
- Analysér test- og kontrolområderne ved hjælp af ImageJ og en brugerdefineret mobilapplikation.
7. Kvantificering med mobilapplikation
BEMÆRK: Intensiteten af papirbaseret immunoassay analyseres i mobilapplikationen (figur 2).
- Åbn den udviklede mobilapplikation på smartphonen.
- Vælg Brug kamera eller Overfør fra galleri for at vælge eller overføre datakilden. Gør dette gennem kameraoptagelse eller ved at vælge et billede fra enhedens galleri.
- Naviger til det analytiske afsnit, og tryk på knappen Analysér på skærmen.
- Vent på, at applikationen analyserer dataene og viser resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Valg af fremstillingsmetode er afgørende for at sikre reproducerbare assay-præstationer i papirbaserede immunoassay-enheder. I vores undersøgelse undersøgte vi forskellige fremstillingsprocesser og materialer i forbindelse med demonstration af et papirbaseret immunassay. Vores valgte metode bruger et vokstryksystem til at skabe hydrofobe barrierer inden for papirbaserede mikrofluidiske enheder. Denne tilgang skiller sig ud på grund af dens enkelhed, hastighed og ensartede resultater. Det skal bemærkes, at det giver fordelen ved at undgå brugen af fotoresistkemikalier, som har potentialet til at forstyrre proteinadsorption og øge hydrofobicitet af cellulosepapir. Desuden sikrer vokstryk ensartede dimensioner af fluidiske kanaler, hvilket bidrager til gentagelig analyseydelse.
Efter dannelsen af hydrofobe barrierer blev de nødvendige reagenser til immunoassay påført cellulosepapiroverfladen. Med elektrostatisk adsorption assisterede PLL i biomolekyleimmobilisering ved at interagere med både den positive ladning af aminfunktionelle grupper og det negativt ladede antistof. Dette trin letter modifikation og immobilisering af antistoffer og anvendelse af etiket-antistofkonjugater under fremstillingsprocesserne. Det er vigtigt, at dette trin kan udføres parallelt. Samlingen af papirimmunoassayindretningerne (DEN-NS1-PAD, som vist i figur 1A) afsluttes ved at stable det modificerede papir på et klæbende plastbagsidekort og laminere det med en plastfilm.
Hovedformålet med denne undersøgelse er at udvikle en brugervenlig metode ved hjælp af en smartphone til måling af NS1-koncentrationer. Denne tilgang kan bruges som en POCT-enhed (point-of-care testing) i både hjemme- og kliniske omgivelser. I betragtning af den brede vifte af NS1-koncentrationer i patientserum blev der anvendt enkle lineære modeller baseret på resultaterne af disse eksperimenter. For hver NS1-koncentration blev der udarbejdet et datasæt bestående af tre testenheder. Billeder af enhederne blev taget ved hjælp af en smartphone under standardindstillinger og optimale lysforhold, hvilket eliminerer behovet for en mørk boks. Testzonen for PAD'erne indeholder muse dengue NS1 monoklonalt antistof, mens kontrolzonen har ged anti-mus IgG-antistof. Med et sandwichanalyseformat svarer højere NS1-koncentrationer i prøver til øget intensitet af rød farve i testzonen. I modsætning hertil forbliver farveintensiteten i kontrolzonen relativt konstant. Figur 1B viser ubehandlede smartphone-billeder, som giver en fordelagtig visuel observation uden at kræve specialudstyr.
Ved hjælp af en dedikeret mobilapplikation normaliserede vi intensiteterne og beregnede enkle lineære modeller for spikede NS1-koncentrationer i serumprøver - koefficientkorrelationen (r2) opnået fra mobilapplikationen. Koefficientkorrelationen (r2) opnået fra mobilapplikationen var 0,92 (figur 3), hvilket var i overensstemmelse med forventningerne. Denne smartphone-baserede tilgang overgik observation med det blotte øje, hvilket signifikant øgede følsomheden med 178%. Derudover blev blindprøvegrænsen (LoB), detektionsgrænsen (LoD) og kvantificeringsgrænsen (LoQ) beregnet for de normaliserede intensiteter, som vist i tabel 1.
Kliniske prøver fra den virkelige verden blev brugt til at demonstrere den praktiske funktionalitet af DEN-NS1-PAD'er i kliniske omgivelser. Det papirbaserede immunoassay producerede kvalitative farveaflæsninger inden for 20-30 minutter, hvilket muliggør visuel bestemmelse af negative eller positive resultater. Serumprøver fra patienter, der mistænkes for denguefeber, blev udsat for enheden. Figur 4 illustrerer og sammenligner resultaterne fra både udstyret og en kommerciel hurtig diagnostisk test (RDT). Tabel 2 opsummerer resultaterne af visuelle aflæsninger og det smartphone-baserede system. Den kommercielle RDT og enheden gav lignende resultater med syv positive og 23 negative resultater fra visuel læsning. I modsætning hertil rapporterede det smartphone-baserede læsersystem, der udelukkende blev anvendt på enheden, ni positive og 21 negative resultater fra kliniske prøver.
Figur 1: Billeder af designet og fremstillet DEN-NS1-PAD. (A,B) En enkelt kanal fra den voksmønstrede hydrofobe barriere er designet og afbildet i tre tilstande (C) før og (D,E) efter tilførsel af prøveopløsningen til det udpegede område og viser henholdsvis (D) negative og (E) positive resultater. Prøveopløsningen væger gennem kanalen (se pilen mærket) og interagerer med komponenterne på nøgleplaceringer-AuNPs-Ab ved konjugatområdet, anti-NS1-antistof ved testområdet (indikerer et positivt dengue NS1-resultat) og anti-mus IgG ved kontrolområdet. Resultaterne kan let observeres med det blotte øje og kan kvantificeres ved billedbehandling ved hjælp af en flatbedscanner eller smartphone-kamera. Forkortelse: AuNPs-Ab = guldnanopartikler-antistofkonjugat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skærmbilleder af telefonens skærm fra mobilappen. (A) Brugerskærm for Android-applikationen, der kører på mobiltelefonenheden, (B) visning af applikationsskærm, (C) hovedmenu i applikationen, som brugerne kan vælge at bruge kamera eller uploade billede fra galleri, (D) visning af et relateret billede til test, (E) visning af nedtællingstiden til analyse, F) visning af testresultater, herunder test- og kontrolzonens intensitet, beslutning om infektion (positiv/negativ) og koncentration af NS1 i prøven. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Lineær kalibreringskurve til NS1-detektion i serum. Enheden blev brugt og billeder fortolket ved behandling via en applikation baseret på smartphone-data. Fejlbjælkerne viser ±1 standardafvigelse, n = 3. Forkortelser: T = testområde; C = kontrolområde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Billede af DEN-NS1-PAD fra den kliniske prøveanalyse. Serum (50 μL) blev anvendt i et papirbaseret immunassay. (A) Eksempel på negativt resultat, (B) positive resultater, (C) samlede resultater og sammenligning af RDT versus papirbaseret immunoassay. Forkortelser: RDT = hurtig diagnostisk test; Pos = positiv; Neg = negativ. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parameter | Nøgne øjne | Mobilapp |
| Grænse for blindprøve (LoB) | - | 43,15 ng ml-1 |
| Detektionsgrænse (LoD) | 200 ng ml-1 | 112,19 ng ml-1 |
| Bestemmelsesgrænse (LoQ) | - | 373,58 NG ml-1 |
Tabel 1: LoB, LoD og LoQ fra ImageJ og mobilapplikation på datakalibreringsstandard NS1 i serum. Forkortelser: LoB = grænse for blind; LoD = detektionsgrænse LoQ = kvantificeringsgrænse.
| Patient nr. | Nøgne øjne | Smartphone App | BilledeJ | |
| RDT | Papirbaseret immunoassay | |||
| 1 | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - |
| 3 | - | - | - | - |
| 4 | - | - | - | - |
| 5 | - | - | - | - |
| 6 | - | - | - | - |
| 7 | - | - | - | - |
| 8 | - | - | - | - |
| 9 | + | + | + | + |
| 10 | - | - | + | + |
| 11 | - | - | - | - |
| 12 | + | + | + | + |
| 13 | - | - | - | - |
| 14 | - | - | - | - |
| 15 | - | - | - | - |
| 16 | + | + | + | + |
| 17 | + | + | + | + |
| 18 | - | - | - | - |
| 19 | - | - | - | - |
| 20 | - | - | - | - |
| 21 | + | + | + | + |
| 22 | + | + | + | + |
| 23 | - | - | - | - |
| 24 | + | + | + | + |
| 25 | - | - | - | - |
| 26 | - | - | - | - |
| 27 | - | - | - | - |
| 28 | - | - | - | - |
| 29 | - | - | - | - |
| 30 | - | - | + | + |
Tabel 2: Sammenligning af visuel aflæsning og smartphone-baserede læsersystemresultater for serumprøver. (+) og (-) angiver henholdsvis positive og negative fortolkninger af resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et af de vigtige designparametre for et smartphone-baseret læsersystem er evnen til at levere reproducerbar billedbehandling af prøver. I denne undersøgelse blev billederne for enkelhed og bekvemmelighed taget fra tre forskellige smartphone-mærker med 12-13 MP-kameraer uden brug af en billedboks eller tilbehør. Variable betingelser for billedoptagelse, såsom kameraets opløsning, billedoptagelsestid, lysforhold og miljø, kan påvirke farveintensiteten af test- og kontrolpunkterne på enheden. Virkningen af forskellige billedoptagelsestider på belysning og tørring af PAD på enhedernes signalintensiteter blev minimeret ved hjælp af de normaliserede signalintensiteter, som forblev konsistente på tværs af billeder taget på forskellige tidspunkter36. Subtraktion af baggrundssignaler opstod som en strategi til at forbedre nøjagtigheden af farveintensitetsmålinger, hvilket effektivt afbøder indflydelsen af lysforholdene. Vores fund stemmer overens med tidligere forskning, der fremhæver effektiviteten af baseline eller baggrundssubtraktionsteknikker til minimering af miljøpåvirkninger 39,40.
Den igangværende debat omkring overlegenheden af at bruge en billedbehandlingsboks eller en tilbehørsfri metode har konsekvenser for billedbehandling39,41. En billedbehandlingsboks kan forbedre robustheden af billedbehandlingsresultater ved at minimere variationer i billeddannelsesforhold 41,42,43. I denne undersøgelse brugte vi en mobilapplikation baseret på cloud-maskinlæring til billedbehandling. Denne tilgang udnytter maskinel indlæring på en skybaseret platform til automatisk at klassificere, udtrække og forbedre billeddata. Programmet identificerede og behandlede effektivt interesseområdet inden for billeder, der omfatter baggrunds-, test- og kontrolzoner. Dette trin var afgørende for at skelne mellem disse zoner38. Tidligere forskning tyder på, at billedbehandling, der involverer maskinindlæring, giver overlegen klassificering mellem resultater for kontrol- og testprøver 43,44,45. I denne undersøgelse genererede anvendelsen af den faste placering og baggrundssubtraktion et konsistent baggrundssignal fra cellulose μPAD'erne, hvilket forbedrede konsistensen og klassificeringsnøjagtigheden af aflæsninger leveret af mobilapplikationen40,43.
Med hensyn til de konsistente præstationer ved demonstration af et papirbaseret immunoassay spiller fremstillingsmetoden en vigtig rolle. I en tidligere undersøgelse36 blev flere optimeringsbetingelser for design og fremstillingsmetode af DEN-NS1-PAD, såsom koncentrationer af PLL, blokerende stof og NS1-antistof, undersøgt. Enheden testede NS1 med succes i buffer, cellekultur og humant serum både kvalitativt og kvantitativt.
Matrixeffekter fra serumkomponenter kan interferere med udstyrets detektionsgrænse ved testning af serumprøver. Resultaterne indikerer imidlertid, at det udviklede immunassay med succes kunne detektere NS1-koncentrationer i serumprøver, hvilket gav resultater, der kan sammenlignes med resultaterne af den kommercielle RDT (tabel 2). De tilsyneladende resultater ved hjælp af visuel inspektion og mobilapplikationen (figur 4) blev observeret, hvilket understregede assayets effektivitet til serumtestning. Selv om serumets højere viskositet kan påvirke analysetiderne, hindrer det ikke resultatfortolkning36. Brug af en mobilapplikation kan give mere positive resultater for prøveanalyser, fordi brug af en mobilapplikation forbedrer følsomheden af prøvetestbetydeligt 46. Det er værd at bemærke, at yderligere sammenligninger med molekylære assays såsom RT-PCR 15,47,48 for dengue NS1 er nødvendige for at bestemme potentielle falsk-positive eller falsk-negative resultater.
En bemærkelsesværdig begrænsning af denne undersøgelse opstår, når man overvejer en mere kompleks prøvematrix såsom blod. De komponenter, der er til stede i blod, kan faktisk forstyrre enhedens detektionsgrænse. I sådanne tilfælde udgør anvendelse af yderligere absorberende puder til forbedring af løbende bufferabsorption en potentiel løsning. Denne ændring kan hjælpe blodkoagulation, udnytte celluloses hæmotypiske egenskaber ved at påvirke blodplader49. En anden tilgang indebærer at anvende 4% (w / v) saltvandsdråber til prøvepuden for at forbedre blodkoagulationen. Tidligere forskning har vist, at salte som calciumchlorid og natriumchlorid inducerer koagulation af røde blodlegemer (RBC)50,51. Na+ kan destabilisere suspensionen af RBC'er i blodet ved at undertrykke det elektriske dobbeltlag på RBC-overfladen og reducere ladningsfrastødningen mellem RBC'er. Derudover inducerer en høj koncentration af salt også blodaggregering52. Desuden undertrykker modionvalensladningen af Na+ tykkelsen af det ladede dobbeltlag af RBC'er, hvilket fører til aggregering af de deflaterede RBC'er. Tilsætningen af 4% (w/v) saltopløsning (NaCl) letter plasmaseparation på cellulosepapir51. Imidlertid er omhyggelig optimering af saltvandskoncentrationen nødvendig for at undgå at fremkalde uønskede virkninger på blodaggregering og guldnanopartikelaggregering53,54.
Kommercielle voksprintere gav en ideel kombination af omkostninger og enkelhed ved prototyping. Da disse printere blev afbrudt i 2016, var der behov for alternative fremstillingsmetoder såsom inkjetudskrivning55, serigrafi56 og fotolitografi57. En kontortonerprinter er en god kandidat til fremstilling af μPAD. Polyesterharpiksen i toneren skaber hydrofobe mønstre ved 200 °C i 60 minutter med forskellige designs58.
Antistof NS1 serotype to, som specificeret af virksomheden, blev anvendt i denne forskning. Vi fandt imidlertid, at dette antistof også interagerer med alle serotyper36,37. Følsomheden for detektion af DENV-4 er lavere (87,5 %) sammenlignet med andre serotyper. Følsomheden af DENV-1 og DENV-2 er ca. 88,89 %, og for DENV-3 er den 100 %37. Disse resultater stemmer overens med tidligere forskning, som også rapporterede lavere følsomhed af RDT over for DENV-4 sammenlignet med andre serotyper59. Enhedens samlede følsomhed er ~ 88.89% med en specificitet på ca. 86.67%. Det er bemærkelsesværdigt, at den faktiske følsomhed af DEN-NS1-PAD kan overgå den kommercielle RDT. RDT viser imidlertid en positiv prædiktiv værdi (PPV) på 84,62% og en nøjagtighed på 87,67%. Især klarede DEN-NS1-PAD sig bedre til at detektere dengue-infektion i de første 5-6 dage, mens RDT kun er effektiv i de første 5 dage37.
Sammenfattende er kombinationen af et bærbart papirbaseret immunoassay (DEN-NS1-PAD) med en smartphone-applikation meget lovende for dengue NS1-måling. Den mobile applikation forbedrer følsomheden og effektiviteten betydeligt ved kvantificering af NS1 i serumprøver sammenlignet med observation med det blotte øje. Mobilapplikationens fordele inkluderer reduceret analysetid, brugervenlighed og kompatibilitet med forskellige smartphone-enheder, positioner og lysforhold. Der er dog behov for yderligere forbedringer for at forbedre følsomheden og ydeevnen. I mellemtiden er modifikation af det papirbaserede immunoassay nødvendigt for at forbedre dets ydeevne, når man beskæftiger sig med blodprøver. Desuden kræves omfattende evalueringer af DEN-NS1-PAD til påvisning af dengue ved hjælp af et mere signifikant antal primære infektionsserotyper og udvalgte prøver indsamlet fra forskellige patienter (børn og voksne).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
MHP anerkender taknemmeligt stipendieforskningsfonden fra Universitas Islam Indonesia (UII). Forfatterne udtrykker deres taknemmelighed til Mr. Nutchanon Ninyawee for hans værdifulde ekspertise og hjælp gennem hele udviklingen af mobilapplikationen og hans bidrag til manuskriptet. Desuden sætter forfatterne pris på den økonomiske støtte fra Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (projektnr. FRB660073/0164) under Program Smart Healthcare of King Mongkut's University of Technology Thonburi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10x30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
- Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
- World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
- WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
- Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
- Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
- Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
- Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
- Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
- Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
- Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
- Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
- Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
- Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
- World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
- Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
- Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
- Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
- Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V.
- Hu, J., et al.
- Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
- Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
- Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
- He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
- Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
- Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
- Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
- Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D.
- Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
- Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
- Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
- Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
- Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
- You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
- Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
- Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
- Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. Prabowo, M. H., et al. , 1901000816 (2019).
- Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
- Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
- Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
- Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
- Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
- Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
- Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
- Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
- Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
- Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
- Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
- Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
- Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
- Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
- Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
- Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
- Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
- Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
- Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).
