Summary
För att ta itu med brådskande behov av denguediagnostik introducerar vi här en smartphone-app-integrerad Dengue NS1 Paper-based Analytical Device (DEN-NS1-PAD) för kvantifiering av Dengue NS1-antigenkoncentration i kliniska serum-/blodprover. Denna innovation förbättrar hanteringen av denguefeber genom att underlätta kliniskt beslutsfattande i olika vårdmiljöer, även resursbegränsade sådana.
Abstract
Denguevirusinfektion (DENV), som överförs av Aedes-myggor , är ett stort folkhälsoproblem i tropiska och subtropiska länder. Med en årlig incidens på cirka 10 miljoner fall och 20 000-25 000 dödsfall, särskilt bland barn, finns det ett akut behov av praktiska diagnostiska verktyg. Förekomsten av icke-strukturellt dengueprotein 1 (NS1) under tidig infektion har kopplats till cytokinfrisättning, vaskulärt läckage och endoteldysfunktion, vilket gör det till en potentiell markör för svår dengue.
Pappersbaserade immunanalyser som laterala flödesanalyser (LFA) och mikrofluidiska pappersbaserade analysanordningar (PAD) har vunnit popularitet som diagnostiska tester på grund av deras enkelhet, snabbhet, billighet, specificitet och enkla tolkning. Konventionella pappersbaserade immunanalyser för detektion av NS1 i denguefeber förlitar sig dock vanligtvis på visuell inspektion och ger endast kvalitativa resultat. För att ta itu med denna begränsning och förbättra känsligheten föreslog vi en mycket portabel NS1-detektionsanalys av denguefeber på en pappersbaserad analysenhet (PAD), nämligen DEN-NS1-PAD, som integrerar en smartphone-applikation som en kolorimetrisk och kvantitativ läsare. Utvecklingssystemet möjliggör direkt kvantifiering av NS1-koncentrationer i kliniska prover.
Serum- och blodprover från patienter användes för att demonstrera systemprototypens prestanda. Resultaten erhölls omedelbart och kan användas för klinisk bedömning, både i välutrustade vårdinrättningar och i resursbegränsade miljöer. Denna innovativa kombination av en pappersbaserad immunanalys med en smartphone-applikation erbjuder ett lovande tillvägagångssätt för förbättrad detektion och kvantifiering av NS1-dengueantigen. Genom att öka känsligheten bortom blotta ögats kapacitet har detta system stor potential för att förbättra det kliniska beslutsfattandet vid hantering av denguefeber, särskilt i avlägsna eller underbetjänade områden.
Introduction
Denguevirusinfektion (DENV) är den myggburnasjukdomen som sprids snabbast 1, och mer än 390 miljoner människor är infekterade med 96 miljoner symtomatiska infektioner, 2 miljoner fall av allvarlig sjukdom och mer än 25 000 dödsfall per år inträffar i världen 1,2. Enligt Världshälsoorganisationen (WHO) är uppskattningsvis 3,9 miljarder människor i riskzonen för denguefeber. ~70% bor i länder i Asien och Stillahavsområdet och främst i Sydostasien3. År 2019 rapporterades 4,2 miljoner fall av denguefeber till WHO, och Thailand bidrog med minst 136 000 fall av denguefeber och 144 dödsfall till följd av dengueinfektion4. Dengueutbrottet i Thailand sker under regnperioden, från april till december, i både stads- och landsbygdsområden, särskilt i det nordöstra området.
DENV-infektioner har olika kliniska manifestationer som sträcker sig från subkliniska symtom, mild denguefeber (DF) till svår dengue hemorragisk feber (DHF). Det huvudsakliga kännetecknet för allvarligt DHF-tillstånd är ökad vaskulär permeabilitet följt av chock och organdysfunktion1. Att förstå den molekylära vägen som kan orsaka kärlläckage är mycket viktigt för att utveckla effektiva denguebehandlingar. Dengue icke-strukturellt protein 1 (NS1) är ett utsöndrat glykoprotein under tidig virusinfektion 5,6, och det fungerar som en kofaktor för viral RNA-replikation7. NS1 kan utlösa cytokinfrisättning och bidra till vaskulärt läckage genom att binda till toll-like receptor 4 (TLR4) och endotelglykokalyx 8,9. In vitro-forskning har visat att NS1 interagerar med endotelceller och inducerar apoptos. Detta tillstånd kan bidra till endoteldysfunktion och vaskulärt läckage10. NS1-antigennivåer, korrelerade med serumnivåer av interleukin (IL)-10, ökade signifikant hos patienter med svår klinisk sjukdom11. Dengue NS1 bidrar också till sjukdomspatogenesen genom att inducera IL-10 och undertrycka DENV-specifika T-cellssvar12,13. Dessutom var NS1-proteinet denguefeber relaterat till svår klinisk sjukdom, och koncentrationen av NS1 > 600 ng ml-1 under de första 3 dagarna av sjukdomen var associerad med utvecklingen av DHF14.
Persistensen av dengue NS1-antigenet hos patienter med DHF kan användas som en markör för svår dengue6. Det finns flera metoder för att detektera NS1 i kliniska prover, t.ex. enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) och snabbtest15. Guldstandarden för att mäta koncentrationen av NS1-proteiner i en klinisk miljö är ELISA-metoden. ELISA-metoden är dock dyr och kräver kvalificerad personal och laboratorieutrustning16. Därför pågår fortfarande utvecklingen av teknik för att detektera och kvantifiera NS1-proteiner i patientnära test (POCT). Under det senaste decenniet har pappersbaserade immunanalyser som laterala flödesanalyser (LFA) och mikrofluidiska pappersbaserade analysanordningar (μPAD) blivit populära som diagnostiska tester på grund av deras enkelhet, snabbhet, billighet och specificitet 17,18,19. I en pappersbaserad immunanalys har flera etiketter använts för att generera signaler, såsom guldnanopartiklar (AuNPs)20, magnetiska nanopartiklar21,22, kvantprickar23 och fluorescensmaterial24,25. AuNP är de vanligaste etiketterna som används i pappersbaserade immunanalyser på grund av deras billiga produktionskostnad, enkla tillverkning, stabilitet och enkla avläsning. För närvarande används laterala flödesanalyser (LFA) för dengue NS1 i den kliniska miljön26,27. Konventionell LFA-etikettdetektering använder dock vanligtvis blotta ögat och ger endast kvalitativa resultat.
Under det senaste decenniet har mer än 5 miljarder smartphones använts i stor utsträckning globalt, och det finns potential för att utveckla bärbar detektering 28,29. Smartphones har multifunktionell kapacitet som inbyggda fysiska sensorer, flerkärniga processorer, digitalkameror, USB-portar, ljudportar, trådlös och applikationsprogramvara, vilket gör dem lämpliga för användning i olika biosensorplattformar30. Dessutom gör trådlös teknik det möjligt att skicka data snabbt och kan användas för övervakning i realtid och på plats31. Mudanyali et al. kombinerade den pappersbaserade immunanalysen och smartphones för att utveckla en bärbar, utrustningsfri, snabb, billig och användarvänlig POCT-plattform för malaria, tuberkulos och HIV32. Ling et al. rapporterade en lateral flödesanalys i kombination med en smartphonekamera för att kvantitativt detektera alkalisk fosfatasaktivitet i mjölk33. Hou et al. utvecklade också ett smartphone-baserat, dual-modality imaging system för kvantitativa signaler från färg eller fluorescens i den laterala flödesanalysen34. Att använda smarttelefonen som en kolorimetrisk och kvantitativ läsare kan dessutom förbättra känsligheten medan blotta ögat inte med säkerhet kan rapportera närvaron av målet35.
DEN-NS1-PAD 36,37,38 (hädanefter kallad enheten) är ett genombrott inom denguediagnostik och erbjuder en bärbar och effektiv lösning. Med hjälp av vaxtryckt mikrofluidisk pappersbaserad teknik kvantifierar denna enhet NS1 med hög känslighet och specificitet genom bildbehandling. För att ytterligare förbättra dess användbarhet har vi utvecklat en användarvänlig smartphone-app för kolorimetrisk och kvantitativ avläsning. Klinisk validering med hjälp av patientprover från thailändska sjukhus understryker dess omedelbara inverkan på patientbedömning i realtid. Vår innovation markerar ett avgörande framsteg inom strömlinjeformad, patientnära denguehantering, och lovar att revolutionera diagnostiken i resursbegränsade vårdlandskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikkommittén vid Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailand (IRBRTA 1218/2562) beviljade godkännande. När vi genomförde denna studie följde vi alla nödvändiga etiska regler.
1. Tillverkning av produkter för den pappersbaserade immunanalysen
OBS: Den pappersbaserade immunanalysenheten tillverkades enligt tidigare etablerade metoder36,37 och thailändsk patentansökan nr 19010081638.
- Design och mönsterritning: Designa pappersanalysanordningen (Figur 1A,B) med 18 PAD-vaxmönster på en dator.
OBS: Designen är specifik och avsedd för papper i A5-storlek. Antalet PADs är relaterat till storleken på papperet, beroende på vad användaren behöver. - Skriv ut det designade mönstret på cellulosapapperet med hjälp av en vaxskrivare (Table of Materials).
- Smält det vaxtryckta papperet i en laboratorieugn i 75 s vid 150 °C. Förvara den sedan i en kiseldioxidlåda tills den behövs för de efterföljande stegen.
- Applicera 0,5 μL 0,025 % poly-L-lysin (PLL) på både test- och kontrollområdena. Inkubera i rumstemperatur (RT) i 2 min i en kiseldioxidlåda och värm sedan i ugnen på 65 °C i 5 min.
- Applicera 0,5 μl av 1 μg μL-1 get-antimus-IgG-antikropp på kontrollområdet och 0,5 μL av 1 μg μL-1 av avskiljningsantikroppen på testområdet. Låt dropparna torka i en kiselgellåda vid RT i 30 min.
- Applicera 2 μL av blockeringsbufferten på provområdet, 3 μL på konjugatområdet och 2 μL på detektionsområdet. Låt dropparna torka vid RT i en kiselgelbox i 30 min.
- Applicera 2 μL guldnanopartikel-antikroppskomplex (AuNPs-Ab) lösning på konjugatområdet och låt den torka i en kiselgellåda vid RT i 30 minuter.
2. Montering av den pappersbaserade immunanalysen
- Ta försiktigt bort skyddsfilmen på baksidan av det självhäftande plastbakkortet för att exponera limmet.
- Rikta in det behandlade cellulosapappret med det självhäftande plastkortet och tryck ihop de två lagren ordentligt.
OBS: Undvik att vidröra det hydrofila fältet för att minimera risken för kontaminering eller skada på enheten. - Applicera en plastfilm för att belägga pappret och tryck ihop dem.
- Klipp ut den önskade delen av enheterna med en sax från ark av helt monterade enheter.
- DEN-NS1-PADs (Figur 1C) är nu redo att användas. För långsiktig stabilitet, förvara dem vid 4 °C.
3. Beredning av AuNPs-Ab-konjugatet
OBS: AuNPs-Ab utarbetades enligt beskrivningen tidigare av Prabowo et al.36.
- Kombinera 10 μl 1 mg ml-1 anti-NS1-antikropp i PBS, 1 ml 40 nm AuNP-kolloid och 0,1 ml 0,1 M boratbuffert (pH 8,5).
- Rotera blandningen vid 50 rpm i 60 min och inkubera vid RT.
- Applicera 0,1 ml 10 mg ml-1 BSA i BBS, rotera med 50 rpm och inkubera vid RT i 15 min.
- Centrifugera lösningen vid 20,187 × g och 4 °C i 30 minuter.
- Pipettera försiktigt och separera supernatanten från den utfällda AuNPs-Ab.
- Återsuspendera AuNPs-Ab i 500 μL BBS och dispergera den med hjälp av ultraljudsbehandling.
- Upprepa centrifugeringen vid 20,187 × g och 4 °C i 30 minuter.
OBS: Upprepa dispersions- och centrifugeringsprocesserna 3x. - Tillsätt 50 μl konjugatbuffert till suspensionen så att den är klar för applicering på konjugatområdet.
4. Utveckling av mobilapplikationer
- Utveckling av bildbehandling och maskininlärning
- Samla in en datauppsättning för en övervakad bildmodell genom att samla in över 900 autofokusbilder av DEN-NS1-PAD:er, fånga olika förhållanden som olika koncentrationer, kameramärken (12-13 megapixlar), rotationer (90° och 180°) och ljusinställningar. Sikta på 30 bilder under varje specifikt tillstånd.
- Märk grundsanningen genom att identifiera och kommentera två intressanta regioner som test- och kontrollområden i de insamlade bilderna för övervakad inlärning.
- Utforma en algoritm för att identifiera bakgrundsremsan. Lokalisera mittlinjen mellan test- och kontrollregionerna, beräkna dess mittpunkt och upprätta ett kvadratiskt område som är proportionellt mot den genomsnittliga storleken på de två huvudregionerna samtidigt som samma rotationsorientering bibehålls.
- Skapa en bildsegmenteringsmodell med hjälp av datauppsättningen och etiketterna ground truth från steg 4.1.1 och 4.1.2 för att träna en bildsegmenteringsmodell för att identifiera de intressanta regionerna.
- Algoritm för program
- Använd den tränade bildsegmenteringsmodellen på nya bilder för att hitta test-, kontroll- och bakgrundsregionerna automatiskt.
- Använd grundläggande bildbehandlingstekniker för att få ett enda intensitetsvärde för vart och ett av de tre intressanta områdena (test, kontroll och bakgrund).
- Omvandla bilden till en 3D-arrayrepresentation (y, x-kanal) för att komma åt pixelvärden.
- Konvertera bilden till gråskala genom att beräkna medelvärdet av RGB-värden och tillämpa invertering med formeln (255-x).
- Normalisera värdena för test- och kontrollområdet genom att subtrahera värdet för bakgrundsområdet.
- Använd den förutbestämda kalibreringskurvan för att beräkna koncentrationen av NS1.
- Klassificera resultaten som positiva eller negativa baserat på ett gränsvärde på 0,1103 härlett från de normaliserade gråskaleintensiteterna37.
5. Kalibreringskurva och känsligheter
- Bered NS1-prov i humant serum för kalibrering med koncentrationerna 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 och 1,0 μg ml-1.
- Droppa 50 μL av varje koncentration på provytan och utför mätningar i tre exemplar.
- Låt samples sugas in helt i enheten, vilket kan ta 20-30 minuter att få resultat.
- Ta bilder av enheten med en digitalkamera eller smartphone efter 5 minuters inkubation.
- Analysera test- och kontrollområdena med hjälp av ImageJ och en anpassad mobilapplikation.
- Konstruera kalibreringskurvan baserat på data från ImageJ och mobilapplikationen.
- Beräkna blankgränsen (LOB), detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ) med hjälp av ekvationerna (1-3) nedan:
LOB = medelvärdet av tomma data + 1:645* ð (standardavvikelse för blankdata) (1)
LOD = LOB +1:645*ð (standardavvikelse för data för lägsta koncentration) (2)
LOQ = medelvärde av blankdata + 10*ð (standardavvikelse för blankdata) (3)
6. Utföra en pappersbaserad immunanalys med kliniska prover
- Samla in och bearbeta 300 μL perifert blod från 30 patienter på den första dagen av sjukhusvistelsen till lila EDTA-rör, enligt god klinisk praxis.
- Centrifugera blodet vid 2 884 × g och 4 °C i 20 minuter.
- Överför den flytande komponenten (plasma) till ett rent polypropenrör med hjälp av en pipett.
- Förvara plasman omedelbart i frysen vid −20 °C för efterföljande analys.
- Applicera 20 μL plasma på provområdet ovanpå enheten. Tillsätt sedan 30 μl tvättbuffert (0,05 % v/v Tween 20 i 1x fosfatbuffrad koksaltlösning).
- Låt sample att sugas in helt i enheten, vilket kan ta 20-30 minuter att få resultaten.
- Ta bilder av enheten med en digitalkamera eller smartphone efter 5 minuters inkubation i rumstemperatur.
- Analysera test- och kontrollområdena med hjälp av ImageJ och en anpassad mobilapplikation.
7. Kvantifiering med mobilapplikation
OBS: Intensiteten av pappersbaserad immunanalys analyseras i mobilapplikationen (figur 2).
- Öppna den utvecklade mobilapplikationen på smarttelefonen.
- Välj Använd kamera eller Ladda upp från galleriet för att välja eller ladda upp datakällan. Gör detta genom kamerainspelning eller genom att välja en bild från enhetens galleri.
- Navigera till analysavsnittet och tryck på knappen Analysera på skärmen.
- Vänta tills programmet analyserar data och visar resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att välja en tillverkningsmetod är avgörande för att säkerställa reproducerbara analysprestanda i pappersbaserade immunanalysenheter. I vår studie undersökte vi olika tillverkningsprocesser och material i samband med att demonstrera en pappersbaserad immunanalys. Vår valda metod använder ett vaxutskriftssystem för att skapa hydrofoba barriärer i pappersbaserade mikrofluidiska enheter. Detta tillvägagångssätt sticker ut på grund av dess enkelhet, snabbhet och konsekventa resultat. Värt att notera är att det ger fördelen att man undviker användning av fotoresistkemikalier, som har potential att störa proteinadsorptionen och öka hydrofobiciteten hos cellulosapapper. Dessutom säkerställer vaxutskrift konsekventa dimensioner av fluidiska kanaler, vilket bidrar till repeterbar analysprestanda.
Efter bildandet av hydrofoba barriärer applicerades de nödvändiga reagenserna för immunanalysen på cellulosapappersytan. Med elektrostatisk adsorption hjälpte PLL till med immobilisering av biomolekyler genom att interagera med både den positiva laddningen av aminfunktionella grupper och den negativt laddade antikroppen. Detta steg underlättar modifiering och immobilisering av antikroppar och applicering av etikett-antikroppskonjugat under tillverkningsprocesserna. Det är viktigt att detta steg kan genomföras parallellt. Monteringen av immunanalysanordningarna av papper (DEN-NS1-PAD, som visas i figur 1A) slutförs genom att det modifierade papperet staplas på ett självhäftande plastkort och lamineras med en plastfilm.
Huvudsyftet med denna studie är att utveckla en användarvänlig metod som använder en smartphone för att mäta NS1-koncentrationer. Detta tillvägagångssätt kan användas som en POCT-enhet (Point-of-Care Testing) i både hemmiljö och klinisk miljö. Med tanke på det stora intervallet av NS1-koncentrationer i patientserum användes enkla linjära modeller baserade på resultaten av dessa experiment. För varje NS1-koncentration utarbetades en datauppsättning bestående av tre testanordningar. Foton av enheterna togs med en smartphone under standardinställningar och optimala ljusförhållanden, vilket eliminerar behovet av en mörk låda. Testzonen för PADs innehåller monoklonal NS1-antikropp av denguefeber hos möss, medan kontrollzonen innehåller IgG-antikroppar mot möss. Med ett sandwichanalysformat motsvarar högre NS1-koncentrationer i proverna ökad intensitet av röd färg i testzonen. Däremot förblir färgintensiteten i kontrollzonen relativt konstant. Figur 1B visar obearbetade smartphonebilder, som ger en fördelaktig visuell observation utan att kräva specialutrustning.
Med hjälp av en dedikerad mobilapplikation normaliserade vi intensiteterna och beräknade enkla linjära modeller för förhöjda NS1-koncentrationer i serumprover - koefficientkorrelationen (r2) erhållen från mobilapplikationen. Koefficientkorrelationen (r2) som erhölls från mobilapplikationen var 0,92 (figur 3), vilket var i linje med förväntningarna. Detta smartphone-baserade tillvägagångssätt överträffade observation med blotta ögat och förbättrade känsligheten avsevärt med 178 %. Dessutom beräknades blankgränsen (LoB), detektionsgränsen (LoD) och kvantifieringsgränsen (LoQ) för de normaliserade intensiteterna, som visas i tabell 1.
Verkliga kliniska prover användes för att demonstrera den praktiska funktionaliteten hos DEN-NS1-PADs i kliniska miljöer. Den pappersbaserade immunanalysen gav kvalitativa färgavläsningar inom 20-30 minuter, vilket möjliggjorde visuell bestämning av negativa eller positiva resultat. Serumprover från patienter som misstänktes ha denguefeber utsattes för apparaten. Figur 4 illustrerar och jämför de resultat som erhållits från både enheten och ett kommersiellt snabbdiagnostiskt test (RDT). Tabell 2 sammanfattar resultaten av visuella avläsningar och det smartphone-baserade systemet. Den kommersiella RDT:n och enheten gav liknande resultat, med sju positiva och 23 negativa resultat från visuell avläsning. Däremot rapporterade det smartphone-baserade läsarsystemet som uteslutande tillämpades på enheten nio positiva och 21 negativa resultat från kliniska prover.
Figur 1: Bilder av designad och tillverkad DEN-NS1-PAD. (A,B) En enda kanal från den vaxmönstrade hydrofoba barriären är utformad och avbildad i tre tillstånd (C) före och (D,E) efter det att provlösningen har förts in i det avsedda området och de (D) negativa respektive (E) positiva resultaten visas. Provlösningen transporteras genom kanalen (se pilen märkt), interagerar med komponenterna på viktiga platser - AuNPs-Ab vid konjugatområdet, anti-NS1-antikropp vid testområdet (indikerar ett positivt dengue NS1-resultat) och anti-mus IgG vid kontrollområdet. Resultaten är lätta att observera med blotta ögat och kan kvantifieras genom bildbehandling med hjälp av en flatbäddsskanner eller smartphonekamera. Förkortning: AuNPs-Ab = guldnanopartiklar-antikroppskonjugat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Skärmbilder av telefonens skärm från mobilappen. (A) Användarskärm för Android-applikationen som körs på mobiltelefonenheten, (B) visning av applikationsskärmen, (C) huvudmenyn för applikationen som användarna kan välja att använda kamera eller ladda upp bild från galleriet, (D) visning av en relaterad bild för testning, (E) visning av nedräkningstiden för analys, F) Visning av testresultat, inklusive test- och kontrollzonens intensitet, infektionsbeslut (positivt/negativt) och koncentrationen av NS1 i provet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Linjär kalibreringskurva för NS1-detektion i serum. Enheten användes och bilderna tolkades genom bearbetning via en applikation baserad på smartphonedata. Felstaplarna visar ±1 standardavvikelse, n = 3. Förkortningar: T = provningsområde; C = kontrollområde. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bild av DEN-NS1-PAD från den kliniska provanalysen. Serum (50 μL) användes i en pappersbaserad immunanalys. (A) Exempel på negativt resultat, (B) positiva resultat, (C) övergripande resultat och jämförelse av RDT kontra pappersbaserad immunanalys. Förkortningar: RDT = Rapid Diagnostic test; Pos = positiv; Neg = negativ. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Parameter | Blotta ögonen | Mobilapp |
| Gräns för tomt (LoB) | - | 43,15 ng ml-1 |
| Detektionsgräns (LoD) | 200 ng ml-1 | 112,19 ng ml-1 |
| Kvantifieringsgräns (LoQ) | - | 373,58 ng ml-1 |
Tabell 1: LoB, LoD och LoQ från ImageJ och mobilapplikation på datakalibreringsstandard NS1 i serum. Förkortningar: LoB = gräns för blanksteg; LoD = detektionsgräns, LoQ = kvantifieringsgräns.
| Patient nr. | Blotta ögonen | App för smarttelefoner | BildJ | |
| RDT | Pappersbaserad immunanalys | |||
| 1 | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - |
| 3 | - | - | - | - |
| 4 | - | - | - | - |
| 5 | - | - | - | - |
| 6 | - | - | - | - |
| 7 | - | - | - | - |
| 8 | - | - | - | - |
| 9 | + | + | + | + |
| 10 | - | - | + | + |
| 11 | - | - | - | - |
| 12 | + | + | + | + |
| 13 | - | - | - | - |
| 14 | - | - | - | - |
| 15 | - | - | - | - |
| 16 | + | + | + | + |
| 17 | + | + | + | + |
| 18 | - | - | - | - |
| 19 | - | - | - | - |
| 20 | - | - | - | - |
| 21 | + | + | + | + |
| 22 | + | + | + | + |
| 23 | - | - | - | - |
| 24 | + | + | + | + |
| 25 | - | - | - | - |
| 26 | - | - | - | - |
| 27 | - | - | - | - |
| 28 | - | - | - | - |
| 29 | - | - | - | - |
| 30 | - | - | + | + |
Tabell 2: Jämförelse av resultat från visuell avläsning och smartphone-baserade läsarsystem för serumprover. (+) och (-) indikerar positiva respektive negativa tolkningar av resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de viktiga designparametrarna för ett smartphone-baserat läsarsystem är förmågan att tillhandahålla reproducerbar bildbehandling av prover. I den här studien togs bilderna från tre olika smartphone-märken med 12-13 MP-kameror utan att använda en bildbox eller tillbehör. Varierande förhållanden för bildtagning, såsom kamerans upplösning, bildtagningstid, ljusförhållanden och miljö, kan påverka färgintensiteten på test- och kontrollpunkterna på enheten. Effekten av olika bildtagningstider på belysningen och torkningen av PAD på enheternas signalintensiteter minimerades genom att använda de normaliserade signalintensiteterna, som förblev konsekventa över bilder som tagits vid olika tidpunkter36. Subtraktion av bakgrundssignaler uppstod som en strategi för att förbättra noggrannheten i färgintensitetsmätningar, vilket effektivt mildrade påverkan av ljusförhållandena. Vårt resultat är i linje med tidigare forskning som belyser effektiviteten av subtraktionstekniker vid baslinjen eller bakgrunden för att minimera miljöeffekter39,40.
Den pågående debatten kring överlägsenheten i att använda en bildbehandlingsbox eller en tillbehörsfri metod har implikationer för bildbehandling39,41. En bildbehandlingsbox kan förbättra robustheten i bildbehandlingsresultaten genom att minimera variationer i avbildningsförhållandena 41,42,43. I den här studien använde vi en mobilapplikation baserad på molnmaskininlärning för bildbehandling. Den här metoden utnyttjar maskininlärning på en molnbaserad plattform för att klassificera, extrahera och utöka bilddata automatiskt. Applikationen identifierade och bearbetade effektivt intresseområdet i bilder, som omfattar bakgrunds-, test- och kontrollzonerna. Detta steg var avgörande för att skilja mellan dessa zoner38. Tidigare forskning tyder på att bildbehandling som involverar maskininlärning ger överlägsen klassificering mellan utfall för kontroll- och testprover 43,44,45. I denna studie genererade användningen av den fasta platsen och bakgrundssubtraktionen en konsekvent bakgrundssignal från cellulosa μPADs, vilket förbättrade konsistensen och klassificeringsnoggrannheten för avläsningar som tillhandahålls av mobilapplikationen40,43.
När det gäller de konsekventa prestationerna för att demonstrera en pappersbaserad immunanalys spelar tillverkningsmetoden en viktig roll. I en tidigare studie36 studerades flera optimeringsbetingelser för design- och tillverkningsmetoden för DEN-NS1-PAD, såsom koncentrationer av PLL, blockerande substans och NS1-antikropp. Enheten testade framgångsrikt NS1 i buffert, cellkultur och humant serum både kvalitativt och kvantitativt.
Matriseffekter som härrör från serumkomponenter kan störa produktens detektionsgräns vid testning av serumprover. Resultaten indikerar dock att den utvecklade immunanalysen framgångsrikt kunde detektera NS1-koncentrationer i serumprover, vilket ger resultat jämförbara med de för den kommersiella RDT (Tabell 2). De uppenbara resultaten med hjälp av visuell inspektion och mobilapplikationen (figur 4) observerades, vilket understryker analysens effektivitet för serumtestning. Även om serumets högre viskositet kan påverka analystiderna, hindrar det inte tolkningen av resultatet36. Att använda en mobilapplikation kan ge mer positiva resultat för provanalyser eftersom användning av en mobilapplikation avsevärt förbättrar känsligheten för provtestning46. Det är värt att notera att ytterligare jämförelser med molekylära analyser såsom RT-PCR 15,47,48 för dengue NS1 behövs för att fastställa potentiella falskt positiva eller falskt negativa resultat.
En anmärkningsvärd begränsning i denna studie uppstår när man överväger en mer komplex provmatris som blod. De komponenter som finns i blodet kan verkligen störa enhetens detektionsgräns. I sådana fall är det en potentiell lösning att använda ytterligare absorberande dynor för att förbättra absorptionen av löpbufferten. Denna modifiering kan hjälpa blodkoagulationen och utnyttja cellulosans hemostypiska egenskaper genom att påverka blodplättar49. Ett annat tillvägagångssätt innebär att man applicerar 4 % (w/v) saltdroppar på provplattan för att förbättra blodkoagulationen. Tidigare forskning har visat att salter som kalciumklorid och natriumklorid inducerar koagulation av röda blodkroppar (RBC)50,51. Na+ kan destabilisera suspensionen av röda blodkroppar i blodet genom att undertrycka det elektriska dubbelskiktet på RBC-ytan och minska laddningsavstötningen mellan röda blodkroppar. Dessutom inducerar en hög koncentration av salt också blodaggregering52. Dessutom undertrycker motjonvalensladdningen för Na+ tjockleken på det laddade dubbla lagret av röda blodkroppar, vilket leder till aggregering av de deflaterade röda blodkropparna. Tillsatsen av 4 % (w/v) saltlösning (NaCl) underlättar plasmaseparation på cellulosapapper51. Noggrann optimering av saltlösningskoncentrationen är dock nödvändig för att undvika att inducera oönskade effekter på blodaggregering och guldnanopartikelaggregering53,54.
Kommersiella vaxskrivare gav en idealisk kombination av kostnad och enkelhet i prototypframställningen. Eftersom dessa skrivare slutade tillverkas 2016 krävdes alternativa tillverkningsmetoder som bläckstråleutskrift55, screentryck56 och fotolitografi57. En kontorsskrivare är en bra kandidat för tillverkning av μPAD. Polyesterhartset i tonern skapar hydrofoba mönster vid 200 °C i 60 minuter med olika mönster58.
Antikroppen NS1 serotyp två, som specificerats av företaget, användes i denna forskning. Vi fann dock att denna antikropp också interagerar med alla serotyper36,37. Sensitiviteten för detektion av DENV-4 är lägre (87,5 %) jämfört med andra serotyper. Känsligheten för DENV-1 och DENV-2 är cirka 88,89 % och för DENV-3 är den 100 %37. Dessa fynd är i linje med tidigare forskning, som också rapporterade lägre känslighet för RDT för DENV-4 jämfört med andra serotyper59. Enhetens totala känslighet är ~88,89 %, med en specificitet på cirka 86,67 %. Det är anmärkningsvärt att den faktiska känsligheten hos DEN-NS1-PAD kan överträffa den hos kommersiell RDT. RDT visar dock ett positivt prediktivt värde (PPV) på 84,62 % och en noggrannhet på 87,67 %. Noterbart är att DEN-NS1-PAD presterade bättre när det gäller att upptäcka dengueinfektion under de första 5-6 dagarna, medan RDT endast är effektivt under de första 5 dagarna37.
Sammanfattningsvis är kombinationen av en bärbar pappersbaserad immunanalys (DEN-NS1-PAD) med en smartphone-applikation mycket lovande för mätning av NS1 i denguefeber. Mobilapplikationen förbättrar avsevärt känsligheten och effektiviteten vid kvantifiering av NS1 i serumprover jämfört med observation med blotta ögat. Mobilapplikationens fördelar inkluderar minskad analystid, användarvänlighet och kompatibilitet med olika smartphone-enheter, positioner och ljusförhållanden. Ytterligare förbättringar behövs dock för att förbättra känsligheten och prestandan. Samtidigt är modifiering av den pappersbaserade immunanalysen nödvändig för att förbättra dess prestanda vid hantering av blodprover. Vidare krävs omfattande utvärderingar av DEN-NS1-PAD för att upptäcka dengue med hjälp av ett större antal primära infektionsserotyper och utvalda prover som samlats in från olika patienter (barn och vuxna).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
M.H.P. är tacksamma för stipendieforskningsfonden från Universitas Islam Indonesia (UII). Författarna uttrycker sin tacksamhet till Mr. Nutchanon Ninyawee för hans värdefulla expertis och hjälp under utvecklingen av mobilapplikationen och hans bidrag till manuskriptet. Dessutom uppskattar författarna det ekonomiska stödet från Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (projekt nr. FRB660073/0164) under Program Smart Healthcare vid King Mongkuts tekniska universitet Thonburi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10x30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
- Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
- World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for dengue prevention and control. , WHO, Geneva. 1-34 (2012).
- WHO Dengue and severe dengue. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020).
- Department of Disease Control Ministry of Health Thailand. Weekly Disease Forecast Dengue. , (2020).
- Malavige, G. N., Ogg, G. S. Pathogenesis of vascular leak in dengue virus infection. Immunology. 151 (3), 261-269 (2017).
- Paranavitane, S. A., et al. Dengue NS1 antigen as a marker of severe clinical disease. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 570 (2014).
- Muller, D. A., Young, P. R. The flavivirus NS1 protein: Molecular and structural biology, immunology, role in pathogenesis and application as a diagnostic biomarker. Antiviral Research. 98 (2), 192-208 (2013).
- Modhiran, N., et al. Dengue virus NS1 protein activates cells via Toll-like receptor 4 and disrupts endothelial cell monolayer integrity. Science Translational Medicine. 7 (304), 304ra102 (2015).
- Glasner, D. R., et al. Dengue virus NS1 cytokine-independent vascular leak is dependent on endothelial glycocalyx components. PLOS Pathogens. 13 (11), e1006673 (2017).
- Lin, C. -F., et al. Antibodies from dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. Journal of Medical Virology. 69 (1), 82-90 (2003).
- Adikari, T. N., et al. Dengue NS1 antigen contributes to disease severity by inducing interleukin (IL)-10 by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 184 (1), 90-100 (2016).
- Malavige, G. N., et al. Suppression of virus specific immune responses by IL-10 in acute dengue infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2409 (2013).
- Malavige, G. N., et al. Serum IL-10 as a marker of severe dengue infection. BMC Infectious Diseases. 13 (1), 341 (2013).
- Libraty, D. H., et al. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 186 (8), 1165-1168 (2002).
- World Health Organization (WHO) and the Special Programme for Research and Tropical Diseases (TDR). Dengue: guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control -- New edition. , https://www.who.int/publications-detail-redirect/9789241547871 (2009).
- Axelrod, T., Eltzov, E., Marks, R. S. Capture-layer lateral flow immunoassay: a new platform validated in the detection and quantification of dengue NS1. ACS Omega. 5 (18), 10433-10440 (2020).
- Kim, S. -W., Cho, I. -H., Lim, G. -S., Park, G. -N., Paek, S. -H. Biochemical-immunological hybrid biosensor based on two-dimensional chromatography for on-site sepsis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics. 98, 7-14 (2017).
- Fu, Q., et al. Development of a novel dual-functional lateral-flow sensor for on-site detection of small molecule analytes. Sensors and Actuators B: Chemical. 203, 683-689 (2014).
- Dzantiev, B. B., Byzova, N. A., Urusov, A. E., Zherdev, A. V.
- Hu, J., et al.
- Zhong, Y., et al. Gold nanoparticles based lateral flow immunoassay with largely amplified sensitivity for rapid melamine screening. Microchimica Acta. 183 (6), 1989-1994 (2016).
- Figueredo, F., Garcia, P. T., Cortón, E., Coltro, W. K. T. Enhanced analytical performance of paper microfluidic devices by using Fe 3 O 4 nanoparticles, MWCNT, and graphene oxide. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (1), 11-15 (2016).
- Bahadır, E. B., Sezgintürk, M. K. Lateral flow assays: Principles, designs and labels. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 82, 286-306 (2016).
- He, M., Liu, Z. Paper-based micro fluidic device with upconversion fluorescence assay. Analytical Chemistry. 85, 11691-11694 (2013).
- Derikvand, F., Yin, D. L. T., Barrett, R., Brumer, H. Cellulose-based biosensors for esterase detection. Analytical Chemistry. 88 (6), 2989-2993 (2016).
- Kumar, S., Bhushan, P., Krishna, V., Bhattacharya, S. Tapered lateral flow immunoassay-based point-of-care diagnostic device for ultrasensitive colorimetric detection of dengue NS1. Biomicrofluidics. 12 (3), 034104 (2018).
- Sinawang, P. D., Rai, V., Ionescu, R. E., Marks, R. S. Electrochemical lateral flow immunosensor for detection and quantification of dengue NS1 protein. Biosensors and Bioelectronics. 77, 400-408 (2016).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosensors and Bioelectronics. 75, 273-284 (2016).
- Preechaburana, P., Suska, A., Filippini, D.
- Laksanasopin, T., et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Science Translational Medicine. 7 (273), 273re1 (2015).
- Kim, J., et al. Noninvasive alcohol monitoring using a wearable tattoo-based iontophoretic-biosensing system. ACS Sensors. 1 (8), 1011-1019 (2016).
- Mudanyali, O., et al. Integrated rapid-diagnostic-test reader platform on a cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), 2678 (2012).
- Yu, L., Shi, Z., Fang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Li, C. Disposable lateral flow-through strip for smartphone-camera to quantitatively detect alkaline phosphatase activity in milk. Biosensors and Bioelectronics. 69, 307-315 (2015).
- Hou, Y., et al. Smartphone-based dual-modality imaging system for quantitative detection of color or fluorescent lateral flow immunochromatographic strips. Nanoscale Research Letters. 12 (1), 291 (2017).
- You, D. J., Park, T. S., Yoon, J. -Y. Cell-phone-based measurement of TSH using Mie scatter optimized lateral flow assays. Biosensors and Bioelectronics. 40 (1), 180-185 (2013).
- Prabowo, M. H., Chatchen, S., Rijiravanich, P. Dengue NS1 detection in pediatric serum using microfluidic paper-based analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412, 2915-2925 (2020).
- Prabowo, M. H., et al. Clinical evaluation of a developed paper-based Dengue NS1 rapid diagnostic test for febrile illness patients. International Journal of Infectious Diseases. 107, 271-277 (2021).
- Preparation and detection method for the diagnostic device of dengue NS1 detection in serum, cell medium, and buffer. Thai Patent. Prabowo, M. H., et al. , 1901000816 (2019).
- Kong, T., et al. Accessory-free quantitative smartphone imaging of colorimetric paper-based assays. Lab on a Chip. 19 (11), 1991-1999 (2019).
- Jung, Y., Heo, Y., Lee, J. J., Deering, A., Bae, E. Smartphone-based lateral flow imaging system for detection of food-borne bacteria E. coli O157:H7. Journal of Microbiological Methods. 168, 105800 (2020).
- Chen, G., et al. Improved analytical performance of smartphone-based colorimetric analysis by using a power-free imaging box. Sensors and Actuators B: Chemical. 281, 253-261 (2019).
- Kim, H., et al. Smartphone-based low light detection for bioluminescence application. Scientific Reports. 7 (1), 40203 (2017).
- Kim, H., Awofeso, O., Choi, S., Jung, Y., Bae, E. Colorimetric analysis of saliva-alcohol test strips by smartphone-based instruments using machine-learning algorithms. Applied Optics. 56 (1), 84 (2017).
- Qin, Q., et al. Algorithms for immunochromatographic assay: review and impact on future application. The Analyst. 144 (19), 5659-5676 (2019).
- Yan, W., et al. Machine learning approach to enhance the performance of MNP-labeled lateral flow immunoassay. Nano-Micro Letters. 11 (1), 7 (2019).
- Srisa-Art, M., Boehle, K. E., Geiss, B. J., Henry, C. S. Highly sensitive detection of Salmonella typhimurium using a colorimetric paper-based analytical device coupled with immunomagnetic separation. Analytical Chemistry. 90 (1), 1035-1043 (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9 (1), 1391 (2018).
- Lanciotti, R. S., Calisher, C. H., Gubler, D. J., Chang, G. J., Vorndam, A. V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30 (3), 545-551 (1992).
- Yang, X., et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism. Biomaterials Science. 5 (12), 2357-2368 (2017).
- Li, H., Han, D., Pauletti, G. M., Steckl, A. J. Blood coagulation screening using a paper-based microfluidic lateral flow device. Lab Chip. 14 (20), 4035-4041 (2014).
- Nilghaz, A., Shen, W. Low-cost blood plasma separation method using salt functionalized paper. RSC Advances. 5 (66), 53172-53179 (2015).
- Ataullakhanov, F. I., Pohilko, A. V., Sinauridze, E. I., Volkova, R. I. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thrombosis Research. 75 (4), 383-394 (1994).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), 2376 (2014).
- Christau, S., Moeller, T., Genzer, J., Koehler, R., Von Klitzing, R. Salt-induced aggregation of negatively charged gold nanoparticles confined in a polymer brush matrix. Macromolecules. 50 (18), 7333-7343 (2017).
- Abe, K., Kotera, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed paperfluidic immuno-chemical sensing device. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2), 885-893 (2010).
- Sameenoi, Y., Nongkai, P. N., Nouanthavong, S., Henry, C. S., Nacapricha, D. One-step polymer screen-printing for microfluidic paper-based analytical device (µPAD) fabrication. The Analyst. 139 (24), 6580-6588 (2014).
- Mora, M. F., et al. Patterning and modeling three-dimensional microfluidic devices fabricated on a single sheet of paper. Analytical Chemistry. 91 (13), 8298-8303 (2019).
- Ng, J. S., Hashimoto, M. Fabrication of paper microfluidic devices using a toner laser printer. RSC Advances. 10 (50), 29797-29807 (2020).
- Pal, S., et al. Multicountry prospective clinical evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays and two rapid diagnostic tests for diagnosing dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1092-1102 (2015).
