Summary
Detta protokoll beskriver hur man genererar mänskliga bukspottkörtelskivor från avlidna organdonatorer för att studera cellfunktion under nästan fysiologiska förhållanden. Detta innovativa tillvägagångssätt gör det möjligt att undersöka normala och strukturellt skadade öar och det intrikata samspelet mellan endokrina och exokrina fack.
Abstract
Det är viktigt att studera den mänskliga bukspottkörteln för att förstå de patofysiologiska mekanismer som är associerade med typ 1 (T1D) och 2-diabetes (T2D) samt bukspottkörtelns endokrina och exokrina fysiologi och samspel. Mycket har lärts av studiet av isolerade öar i bukspottkörteln, men detta förhindrar att man undersöker deras funktion och interaktioner i ett sammanhang av hela vävnaden. Bukspottkörtelskivor ger en unik möjlighet att utforska fysiologin hos normala, inflammerade och strukturellt skadade öar i deras ursprungliga miljö, vilket i sin tur gör det möjligt att studera interaktioner mellan endokrina och exokrina fack för att bättre undersöka den komplexa dynamiken i bukspottkörtelvävnad. Således representerar antagandet av den levande bukspottkörtelskivplattformen ett betydande framsteg inom området. Detta protokoll beskriver hur man genererar levande vävnadsskivor från avlidna organdonatorer genom vävnadsinbäddning i agaros- och vibratomskivning samt deras användning för att bedöma funktionella avläsningar såsom dynamisk sekretion och avbildning av levande celler.
Introduction
Studier av ö-rötfysiologi är grundläggande för att förstå patogenesen av diabetes och utveckla nya terapeutiska metoder. Hittills har forskningen förlitat sig på isolerade öar, vilket utsätter öarna för mekaniska och enzymatiska påfrestningar, vilket sannolikt orsakar förändringar i cellfysiologin. Dessutom är det inte möjligt att utvärdera öarnas funktion i samband med deras naturliga vävnadsmiljö, som sannolikt påverkas av bland annat exokrina och vaskulära celler1. När man studerar bukspottkörtel från donatorer med T1D finns det en utmaning att deras öar är svåra att isolera och kan bli fragmenterade under isoleringen, vilket kan ge en selektionseffekt på öar som kanske inte representerar befolkningen in vivo2. Dessutom kommer öar att separeras från sin komplexa miljö och cellulära förbindelser, särskilt från de infiltrerande immuncellerna som finns i inflammerade öar och är vanligare i öarnas periferi. Även om isolerade öar är en hörnsten i diabetesforskningen finns det begränsningar. Som svar på detta introducerar vi ett banbrytande protokoll för att generera levande bukspottkörtelskivor, vilket erbjuder en lösning på dessa utmaningar.
Den senaste utvecklingen och användningen av tekniker för skivning av bukspottkörtelvävnad anses vara ett genombrott för vår förmåga att utforska bukspottkörtelns intrikata biologi och funktioner. Denna innovation har öppnat nya vägar för dynamiska studier av öars fysiologi och interaktioner mellan endokrina, exokrina celler, neurala, vaskulära och immunceller inom deras naturliga anatomiska sammanhang. Till skillnad från konventionella metoder bevarar denna in vitro-inställning mycket av organets cytoarkitektur, vilket möjliggör en närmare approximation till dess ursprungliga biologi. Denna metod, som ursprungligen utvecklades på möss av Speier och Rupnik 20033, har visat sig vara användbar för att bedöma kalciumavbildning, elektrofysiologi och hormonutsöndring för både intra- och intercellulär signalering 4,5,6,7,8,9. Plattformen för bukspottkörtelskivor användes sedan för att studera mänsklig bukspottkörtelvävnad som erhållits via kirurgisk biopsi 4,10,11,12. Vår grupp visade att det är möjligt att erhålla och använda skivor av bukspottkörteln från organdonatorer från kadaver genom verksamheten i nätverket för bukspottkörtelorgandonatorer med diabetes (nPOD)13. nPOD tillhandahåller bukspottkörtelvävnader till godkända forskare som bedriver forskning om mänsklig typ 1-diabetes, och sedan nPOD började använda bukspottkörtelplattformen genererar och distribuerar nPOD rutinmässigt levande bukspottkörtelskivor 14,15,16,17. Sedan implementeringen av plattformen för bukspottkörtelskivor 2020 har nPOD framgångsrikt distribuerat vävnadsskivor från 43 donatorer (inklusive 12 donatorer med T1D) till ett stort antal prövare. Med hjälp av dessa skivor utförde forskare banbrytande forskning om kritiska aspekter av öars funktion och utforskade samspelet mellan öar och kärl, nervsystem och immunceller i samband med T1D 13,18,19,20,21,22,23,24. Många studier har belyst begränsningarna med traditionella metoder och understrukit betydelsen av tekniker som kan fånga det dynamiska samspelet i bukspottkörteln 25,26,27. Anpassningsförmågan hos skivningstekniker från mus till mänsklig bukspottkörtel, i kombination med deras integration i program som Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD), exemplifierar det växande erkännandet av metodens potential att låsa upp värdefulla insikter om sjukdomar som typ 1-diabetes.
Protocol
Mänskliga bukspottkörtelsnitt från vävnadsdonatorer av båda könen erhölls via Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) vävnadsbank, University of Florida. Organvävnad från avlidna individer utan identifierare har fastställts vara icke-mänskliga försökspersoner forskning i enlighet med lagar och förordningar om organdonation och klassificerats som icke-mänskliga försökspersoner av University of Florida Institutional Review Board (IRB; IRB nr 392-2008), där man avstår från behovet av samtycke. nPOD-vävnader som specifikt används för detta projekt har godkänts som icke-mänskliga av University of Florida IRB (IRB20140093).
OBS: För läsare som är helt nya till skivtekniken och dess tillämpningar, såsom perifusion och kalciumavbildning, kan det vara lämpligt att få praktisk erfarenhet och utveckla grundläggande färdigheter med hjälp av mus- eller råttskivor 3,28 innan man arbetar med mänskliga prover.
1. Förberedelser
OBS: Dessa förberedelser bör utföras innan vävnaden anländer.
- Förbered HEPES-buffert genom att blanda 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 0,1 % BSA, 2 mM L-alanin, L-arginin och L-glutamin. Justera pH-värdet till 7,4 och filtrera steriliserat.
- Tillsätt glukos och/eller andra stimuli till bufferten för att förbereda lösningar för perifusionsexperiment. Tillsätt 5,5 mM glukos för baslinjebufferten. Denna buffert kommer att användas för skivningsprocedurer, skivinsamling och perifusionsförberedelser.
- Förbered minst två rätter för uppsamling av skivor genom att tillsätta aprotinin (10 μg/ml) till baslinjebufferten.
- Bered 3,8 % agaroslösning med låg smältpunkt i HEPES-buffert utan BSA och aminosyror (125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES) och håll den vid 37 °C.
- Montera vibratomen genom att placera ett nytt blad i hållaren. Om tillämpligt, ställ in bladvinkeln på 15° (om du använder Leica VT1200S). Om tillämpligt, kalibrera vibratomen.
- Slå på perifusionsmaskinen, välj antal kammare och programprotokoll.
- Placera alla nödvändiga lösningar i perifusionsmaskinen, fyll systemet och håll lösningarna uppvärmda. Maskinen beräknar de nödvändiga volymerna för varje lösning som används för protokollet.
2. Bearbetning av vävnader
OBS: Skivor bör genereras omedelbart efter mottagandet. Varje fördröjning kan orsaka svårigheter i ingreppet och leda till vävnadsnedbrytning.
- Placera bukspottkörtelvävnad i en skål med baslinjebuffert under ett stereomikroskop (Figur 1A). Ta försiktigt bort bindväv, fibrotisk och fettvävnad med en pincett och sax.
- Skär vävnaden i flera små bitar på cirka 0,5 cm3 (Figur 1B) med en sax eller en skalpell. Torka torra bitar av bukspottkörteln på silkespapper.
- Överför 4 bitar till en 35 mm petriskål och fyll skålen med agaroslösning tills alla bitar är helt nedsänkta. Låt agaros stelna helt.
- Skär försiktigt ut bitar ur agarosen. Kör skalpellen längs kanten av skålen för att ta bort agarosen och separera försiktigt vävnadsblocken. Se till att bitarna är omgivna av ett tunt lager agaros.
3. Skivning
- Limma vävnadsbitar på vibratomens metallplatta genom att placera dem upp och ner.
- Montera plattan i brickan och fyll brickan med baslinjebuffert (HEPES som innehåller 5,5 mM baslinjeglukos).
- Ställ in vibratomen på automatisk skivning på 120 μm och justera start- och slutposition.
- Flytta bladet kort ovanför vävnaden och börja skära med låg hastighet (0.1 mm/s) och amplitud vid 0.8 mm. Hastigheten kan ökas om vävnaden tillåter det (Figur 1C).
- Samla skivor med hjälp av en böjd pincett eller en liten borste. Ackumulera skivor i baslinjebufferten som innehåller aprotinin (figur 1D).
- Låt skivorna vila i minst 1 timme i baslinjebuffert med aprotinin. Placera skivorna på en långsam orbital shaker för att möjliggöra utspolning av enzymer som frigörs genom skärproceduren.
4. Levande/död analys
OBS: Detta är en valfri analys som kommer att visa livsdugligheten hos vävnadsskivor efter proceduren. Skivor kan dock inte återanvändas när de väl har färgats.
- Överför en enskild sektor i en brunn fylld med baslinjebuffert.
- Tillsätt fluoresceindiacetat (FDA, 50 μg/ml), inkubera i 1 minut i rumstemperatur och skydda mot ljus.
- Tillsätt propidiumjodid (PI,50 μg/ml), inkubera i 1 minut vid rumstemperatur och skydda mot ljus.
- Överför skivan till en annan brunn fylld med PBS för att tvätta i 1 min.
- Överför skivorna till en petriskål eller montera dem på ett glasglas med täckglas för avbildning (Figur 2A,B).
5. Perifusion
OBS: Detta protokoll beskriver hur man utför dynamisk perifusion för vävnadsskivor, men det är också lämpligt för isolerade öar. Ökammare kommer att behöva förberedas med filterpapper och pärllösning innan de laddas enligt beskrivningen i maskinens användarmanual. Ö- och skivkammare kan dock användas tillsammans i samma experiment.
- Välj 3 skivor och putsa ner agarosen till ett minimum under ett stereomikroskop med hjälp av pensel och skalpell.
- Tillsätt en droppe baslinjebuffert (HEPES som innehåller 5,5 mM baslinjeglukos) på rutnätet i skivkammaren och placera försiktigt en skiva på gallret. Upprepa för var och en av de 3 skivorna (Figur 3A). Om skivorna är mycket små, stapla fler än 3 kammare för att öka antalet öar. Lägg inte mer än en skiva per kammare.
OBS: Antalet öar per skiva varierar mycket mellan donatorer och beror på skivstorlek (10-100 öar/skiva). Totalt 3 skivor har visat sig vara tillräckliga för att mäta både insulin- och glukagonsekretion. - För isolerade öar, använd minst 30 öar per kolonn för insulinutsöndring. Rekommenderas att använda 100 öar för glukagondetektion. Montera enskilda delar av skivkammaren uppifrån och ned.
- Anslut skivkammaren till inlopps- och utflödesslangarna i maskinen och starta protokollet (Figur 3C).
- Använd kammarvärme och kylpump för brickor under protokollet. Byt uppsamlingsplattor under protokollet och förvara vid 4 °C om kvantifiering utförs samma dag eller förvara vid -80 °C fram till dess.
- När protokollet är klart, ta bort kamrarna, demontera och samla skivorna för lys (3 % HCl i absolut etanol) eller fixering (i 4 % paraformaldehyd).
- Rengör maskinen genom att spola den med vatten, 10% blekmedel, vatten och luft.
- Kvantifiera hormonutsöndringen med hjälp av kommersiellt tillgängliga detektionskit.
OBS: Figur 4 visar absoluta nivåer av insulin- och glukagonsekretion av 3 skivor för att uppskatta koncentrationsintervall.
6. Avbildning av kalcium
- Bered kalciumfärgämne (t.ex. Fluo4-AM, Calbryte) lösning enligt tillverkarens instruktioner.
- Späd färgämnet i HEPES buffertlösning vid baseline och tillsätt aprotinin (10 μg/ml).
- Överför en enda skiva och inkubera i 30-60 minuter på en orbital shaker i rumstemperatur och skydda mot ljus.
- Under inkubationstiden ska du förbereda bildtagningen av skivan genom att fylla perifusionssprutorna och förbereda slangarna (Figur 5A,B).
- Anslut alla enheter, slå på värmaren och starta pumpflödet. Rekommenderas att använda både inflödesvärme och plattformsvärmare och flödeshastighet på 0,5 ml/min.
- Placera försiktigt en enda skiva i bildkammaren och fäst med en harpa.
- Använd ett objektiv med låg förstoring för att identifiera bildområdet. Att använda reflektion hjälper till att identifiera öområdet (Figur 5C).
- Växla till ett högre förstoringsmål (t.ex. 20x eller 40x) och justera positionen enligt experimentell uppställning.
OBS: För att säkerställa optimal cellviabilitet och öintegritet, rekommenderas att de optiska sektionerna ska vara 1-2 celllager under skärytan. - Ställ in z-stack och/eller skanningsposition för bricka. Ställ in bildintervall och inspelningstid. Här användes en upplösning på minst 256 x 256 för att tillåta diskriminering av enskilda celler, ett avbildningsintervall på 5–10 s och ett z-stackintervall (om tillämpligt) på 30–60 μm med ett intervall på 10 μm mellan plan (ett cellager). Se figur 6 för detaljerade bildinställningar.
OBS: Ställ in bildparametern för att få bästa upplösning och maximal area men undvik att bleka sample. - Starta avbildning och byt lösningsinflöde enligt experiment. När du är klar, samla skivorna och fixera dem för immunhistokemi.
Representative Results
När protokollet utförs framgångsrikt ger 1 g bukspottkörtelvävnad cirka 100-200 skivor. Därefter bör dessa skivor genomgå stereomikroskopinspektion för att identifiera de som är rika på öar innan man fortsätter med funktionella bedömningar. Genomförbarheten, fastställd genom märkning med fluoresceindiacetat (FDA) och propidiumjodid (PI), förväntas uppgå till 80–90 % (figur 2A). Livsdugligheten kan vara märkbart lägre vid skärytan på grund av cellskador under skivningsprocessen. I livsdugliga skivor observeras dynamisk hormonutsöndring (Figur 2B), vilket resulterar i robust insulinfrisättning vid exponering för högt glukos och membrandepolarisering med kaliumklorid (KCl).
Omvänt, när det finns förseningar under skivningsproceduren eller vävnadskvaliteten är suboptimal, skiljer sig resultaten avsevärt. Antalet erhållna skivor kan minska, och viabilitetsbedömningen kan indikera en högre andel icke-viabla celler märkta med PI (figur 2C). I dessa fall indikerar den funktionella bedömningen ett minskat eller till och med frånvarande svar på hög glukos- och membrandepolarisering (Figur 2D). Data från suboptimala experiment illustrerar vikten av exakt utförande i rätt tid och vävnadskvalitet, eftersom de kan leda till minskad vävnadsviabilitet och försämrad funktionalitet. Dessa negativa resultat fungerar som en värdefull påminnelse om de kritiska faktorerna att tänka på för att denna metod ska lyckas.
Vanliga fynd vid kalciumavbildning visualiseras som en värmekarta, som visas i figur 5D, eller som separata spår för enskilda celler, som presenteras i figur 5E. Det är viktigt att betona att färgämnet märker alla celltyper urskillningslöst, därför är specifika stimuli viktiga för att skilja celler baserat på deras svar. För att identifiera livskraftiga celler använder vi KCl och sorterar cellerna baserat på svar som överstiger det genomsnittliga baslinjesvaret med mer än två standardfel. Dessutom kan skivor fixeras och färgas, vilket gör det möjligt att identifiera celltyper.
Figur 1: Bearbetning och skivning av vävnader. A) 1 g obearbetad bukspottkörtelvävnad. (B) Rengjorda bukspottkörtelbitar redo för agarosinbäddning. C) Skivning med vibratom. D) Nyskurna skivor av bukspottkörteln från människan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Uppgifter om vävnadens viabilitet och insulinutsöndring. A) Representativa bilder för livsdugliga vävnadsskivor. Maximal intensitetsprojektion av reflekterat laserljus (grått, överst till vänster), PI för döda celler (rött, nederst till vänster), FDA för levande celler (grönt, nederst till höger) och sammanslagna bilder för levande och döda celler (överst till höger). Prickad linje indikerar en holme. Skalstreck 50 μm. (B) Dynamisk insulinsekretion av vävnadsskivor från human bukspottkörtelvävnad från en enda icke-diabetisk donator. Insulinkinetiken visar ett toppsvar i den första fasen efter 6 minuters hög glukosstimulering, följt av en platå i den andra fasen. Data normaliseras till den genomsnittliga baslinjesekretionen vid 5,5 mM glukos (stimuleringsindex, veckförändring). Sekretionen har utförts på skivor från samma givare som visas i (A). C) Representativa bilder för icke-viabla vävnadsskivor. Maximal intensitetsprojektion av reflekterat laserljus (grått, överst till vänster), PI för döda celler (rött, nederst till vänster), FDA för levande celler (grönt, nederst till höger) och sammanslagna bilder för levande och döda celler (överst till höger). Prickad linje indikerar en holme. Skalstreck 50 μm. (D) Dynamisk insulinsekretion av vävnadsskivor från human bukspottkörtelvävnad från en enda icke-diabetisk donator. Insulinkinetiken visar en tydlig förlust av både glukosstimulerad insulinutsöndring och membrandepolarisering med KCl. Data normaliseras till den genomsnittliga baslinjesekretionen vid 5,5 mM glukos (stimuleringsindex, veckförändring). Sekretionen har utförts på skivor från samma donator som visas i (C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Vävnadsbelastning för dynamisk perifusion. (A) Staplade skivkammare. Enskilda skivor laddas på ett metallgaller som visas i inlagan. (B) Lastning av isolerade holmar i holmkammare. Skiv- och ökammare anslutna till perifusionsmaskin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Hormonutsöndring i skivor och isolerade öar. De data som visas i panelerna A och B kommer från en annan givare än panelerna C och D. (A) Absolut hormonutsöndring från 3 bukspottkörtelvävnadsskivor från en enda icke-diabetisk donator. Insulinsekretionen visas i grönt och glukagonsekretionen i magenta. (B) Hormonutsöndring visad i (A) normaliserad till totalt hormoninnehåll (% av innehållet). Innehållet mäts från alla 3 sektorer som används i experimentet. C) Dynamisk insulinsekretion av isolerade öar (100 öar) och delar av bukspottkörtelvävnad (3 skivor) från samma icke-diabetiska donator. Data visas i absoluta tal (mU/L). (D) Insulinutsöndring visad i (C) normaliserad till total insulinhalt (% av innehållet). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Bildinställning och förväntade resultat. (A) Uppställning för funktionell avbildning med ett upprätt konfokalmikroskop och en perifusionsuppställning. (B) Bildkammare ansluten till inflöde och utflöde. (C) Z-stapel med konfokala bilder av en ö i en vävnadsskiva från en frisk mänsklig donator som visar reflekterat ljus (överst) och Fluo4-signal (nederst). Reflektion används för att identifiera öar inom segmentet (prickad linje). (D) Värmekarta som visar in vitro Ca2+ -dynamik hos ö-celler uttryckt som den fluorescerande intensiteten av Fluo4 normaliserad till den basala signalintensiteten vid 5,5 mM glukos och stimulering med högt glukos (16,7 mM). Varje rad representerar en enskild cell som följs över tid på x-axeln och deras respons i storleksförändring (%) av den fluorescerande intensiteten över baslinjen (dF/F) som visas i färgskalan från blått (låg intensitet) till rött (hög intensitet). (E) Representativa spår av 4 enskilda celler som visar en reaktion på hög glukos. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Inställningar för kalciumavbildning. Skärmdump av programvaran för representativa inställningar som valts för att utföra time-lapse-inspelningar på 40 μm (XYZT-avbildning). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för att generera livskraftiga vävnadsskivor från bukspottkörteln och deras användning för funktionella avläsningar som dynamisk hormonutsöndring och funktionell avbildning. I likhet med isolering av mänskliga öar påverkas framgången för skivproceduren av olika faktorer, inklusive donatoregenskaper, vävnadssändningstid och vävnadskvalitet25,29. Därför är det viktigt att noggrant välja ut vävnadsprover för experimentet och hålla ischemitiderna till ett minimum. I detta sammanhang bör man noga överväga andra potentiella källor till mänsklig vävnad än likdonatorer. Att inkludera kirurgiska donatorer ger möjlighet att kombinera funktionella slice-data med relevant in vivo-information från samma patient, vilket stärker den translationella relevansen11. Denna vävnadskälla för dock med sig andra faktorer eftersom biopsier vanligtvis kommer från äldre patienter som genomgår pankreatektomi, mestadels på grund av en lokaliserad tumör. Noterbart är att biopsier från bukspottkörteln inte utförs i samband med diabetes.
När du utför själva skivningsproceduren är det viktigt att vävnadsbearbetningen sker i rätt tid. Skivor kan lagras i flera timmar, enligt beskrivningen i detta protokoll, eller odlas under längre perioder, enligt beskrivningen av Qadir et al.19. För närvarande är detta protokoll den enda metoden för att upprätthålla livskraften hos skivorna under längre tid, men framtida insatser bör bedöma funktionella förändringar över olika kulturtider och göra jämförelser med isolerade öar, från samma givare.
Det mest kritiska steget i processen är noggrann vävnadsförberedelse innan inbäddning i agaros. Stora kanaler och fibrotisk vävnad kan komplicera skivningsprocessen och potentiellt leda till att vävnadsblock bryter ut ur agarosen. Om detta inträffar och bitarna förblir rimligt stora kan de bearbetas och bäddas in för skivning. Att upprätthålla god vävnadskvalitet och noggrann bearbetning förbättrar avsevärt skivningsprocedurens effektivitet och ger maximal kvantitet och kvalitet på skivorna. Den tid som förflyter från vävnadsförberedelse till generering av skivor bör inte överstiga 2-3 timmar, eftersom längre intervall avsevärt påverkar vävnadens viabilitet.
Ett enkelt men viktigt steg under perifusion av skivan är den exakta trimningen av skivan för att säkerställa en perfekt passform i kammaren. Detta möjliggör ett korrekt bad av vävnaden och ett oavbrutet flöde. När protokollet väl har initierats är det viktigt att undvika ytterligare manipulation av kamrarna för att förhindra oönskade toppar i hormonfrisättningen. Tillräcklig buffert bör förberedas och slangar bör nå lösningens botten för att förhindra att luft sugs och att kamrarna blir torra.
För kalciumavbildning är det viktigt att välja intresseområde noggrant, beroende på experimentella behov och design. Det är viktigt att minimera fotoblekning genom att välja bildparametrar som minskar ljusexponeringen eller förkortar den totala protokolltiden. Precis som vid utsöndring av dynamiska hormoner är det viktigt att upprätthålla ett korrekt lösningsflöde och en uppvärmd miljö, eftersom skivor kräver nästan fysiologiska förhållanden för optimal funktion (t.ex. 37 °C).
Bukspottkörtelns vävnadsskivor upprätthåller effektivt bukspottkörtelns strukturella integritet och bevarar cell-cell-förbindelser mellan dess olika celltyper. Följaktligen ger de ett alternativ till att arbeta med isolerade öar, vilket underlättar samtidig utforskning av både endokrina och exokrina funktioner och deras samspel. För att kunna bedöma samspelet mellan olika celltyper är det viktigt att skilja mellan dem. Färgning efteråt är ett alternativ, men det har begränsningar när det gäller tillgängliga fluorescerande sonder och utmaningen att lokalisera exakta cellager. Därför är det tillrådligt att införliva cellspecifika stimuli i protokollet för att möjliggöra celldiskriminering baserat på svar. För att skilja mellan celltyper i mus- eller humanskivor inkluderar effektiva stimuli adrenalin för alfaceller21,30, ghrelin för deltaceller31, cerulein för acinärceller 5,32, gallsyror för duktala celler33 och noradrenalin för kärlceller22. Liknande stimuli kan användas för att mäta sekretoriska svar. Medan avbildningsstudier fokuserar på enskilda celler, analyserar sekretionsstudier det kollektiva svaret. Därför är det viktigt att inkludera ett stort antal skivor för att upptäcka de önskade resultaten. Den optimala mängden kan variera mellan olika celltyper, där tre skivor är tillräckliga för endokrina celler. Det är dock tillrådligt att använda fler skivor för att säkerställa detekterbarhet snarare än att riskera att missa värdefull information.
Liksom alla andra metoder har vävnadsskivor begränsningar som man bör ta hänsyn till när man tolkar resultaten. Stimulusapplicering riktad mot specifika celltyper kan leda till effekter på andra celltyper i segmentet, vilket kan utlösa återkopplingsslingor. Men de är också viktiga att studera och därför kan uppmätta responser vara mer representativa för en fysiologisk respons. För selektiv cellmålsökning kan traditionella in vitro-protokoll användas. Det är viktigt att acinärceller innehåller bukspottkörtelenzymer som kan bryta ner proteiner och smälta vävnadsskivan, vilket resulterar i cellulär nedbrytning inom några timmar. För att upprätthålla livskraften är det viktigt att använda trypsinhämmare konsekvent när skivorna befinner sig i ett statiskt tillstånd, även om deras användning kan störa den framgångsrika överföringen av virus som används för märkningsändamål.
Jämfört med öisolering kan donatorvariabilitet och vävnadskvalitet påverka både kvantiteten och livskraften hos de erhållna skivorna. Otillräcklig livskraft efter skivning kan resultera i en kort livslängd och hindra förmågan att odla skivorna. Dessutom kan antalet öar variera avsevärt mellan donatorer, vilket gör det svårt att uppskatta öinnehållet innan experiment utförs. Följaktligen är det avgörande att noggrant välja kriterier för godkännande av donatorer och att implementera lämpliga normaliseringsmetoder, såsom procentandelen hormoninnehåll för utsöndring eller veckningsförändring till baslinjen. För konsekventa resultat rekommenderas det att bedöma vävnadsskivans livsduglighet före experimentet. Dessutom rekommenderas att relevanta kontrollstimuli (t.ex. KCl) införlivas i experimentet. Vid analys av enskilda celler, såsom avbildning, kan försortering av celler baserat på deras svar på dessa kontrollstimuleringar genomföras. Trots de nämnda utmaningarna erbjuder skivorna ett värdefullt komplement till nuvarande forskningsmetoder.
Det beskrivna protokollet kan användas som utgångspunkt för flera tillämpningar, och bukspottkörtelns skivor kan manipuleras och svaren undersökas efter en mängd olika stimuli. Vi hänvisar också läsarna till många forskningsstudier som använder skivor från möss eller mänskliga bukspottkörteln, vilket ger värdefulla insikter för dem som planerar sina experiment. I framtiden är det möjligt att potentiella behandlingar kan undersökas med hjälp av bukspottkörtelskivor eller att sjukdomsmekanismer kan modelleras.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning utfördes med stöd av nätverket för bukspottkörtelorgandonatorer med diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), ett samarbetsprojekt för typ 1-diabetes som stöds av JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) och Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). Innehållet och åsikterna som uttrycks är författarnas ansvar och återspeglar inte nödvändigtvis den officiella åsikten hos nPOD. Organ Procurement Organizations (OPO) som samarbetar med nPOD för att tillhandahålla forskningsresurser finns listade på http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Författarna är tacksamma mot donatorerna och deras familjer för deras ovärderliga bidrag. Detta arbete stöddes av American Diabetes Association 4-22-PDFPM (J.K.P.) och Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (anslag 2015-PG-T1D-052).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
| AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
| AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
| AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
| Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
| Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
| Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
| Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
| Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
| Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
| Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
| Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
| Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
| Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
| Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
| Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
| Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |
References
- Abdelli, S., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Lyon, J., et al. Research-focused isolation of human islets from donors with and without diabetes at the alberta diabetes institute isletcore. Endocrinology. 157 (2), 560-569 (2016).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446 (5), 553-558 (2003).
- Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
- Marolt, U., et al. Calcium imaging in intact mouse acinar cells in acute pancreas tissue slices. PLoS One. 17 (6), 0268644 (2022).
- Stozer, A., et al. Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62293 (2021).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS One. 8 (1), e54638 (2013).
- Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released atp to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
- Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. Katp-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar atp. Mol Cell Endocrinol. 230 (1-2), 51-58 (2005).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Mol Metab. 6 (9), 943-957 (2017).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Rep. 31 (1), 107469 (2020).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
- Campbell-Thompson, M., et al. Network for pancreatic organ donors with diabetes (npod): Developing a tissue biobank for type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 28 (7), 608-617 (2012).
- Kaddis, J. S., Pugliese, A., Atkinson, M. A. A run on the biobank: What have we learned about type 1 diabetes from the npod tissue repository. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 22 (4), 290-295 (2015).
- Pugliese, A., et al. New insight on human type 1 diabetes biology: Npod and npod-transplantation. Curr Diab Rep. 14 (10), 530 (2014).
- Pugliese, A., et al. The juvenile diabetes research foundation network for pancreatic organ donors with diabetes (npod) program: Goals, operational model and emerging findings. Pediatr Diabetes. 15 (1), 1-9 (2014).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. J Biol Chem. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nat Commun. 11 (1), 3265 (2020).
- Huber, M. K., et al. Observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62207 (2021).
- Panzer, J. K., Tamayo, A., Caicedo, A. Restoring glutamate receptor signaling in pancreatic alpha cells rescues glucagon responses in type 1 diabetes. Cell Rep. 41 (11), 111792 (2022).
- Mateus Goncalves, L., Almaca, J. Functional characterization of the human islet microvasculature using living pancreas slices. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 602519 (2020).
- Doke, M., et al. Dynamic scrna-seq of live human pancreatic slices reveals functional endocrine cell neogenesis through an intermediate ducto-acinar stage. Cell Metab. 35 (11), 1944-1960 (2023).
- Mateus Goncalves, L., et al. Pericyte dysfunction and impaired vasomotion are hallmarks of islets during the pathogenesis of type 1 diabetes. Cell Rep. 42 (8), 112913 (2023).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85 (7), 950-955 (2008).
- Hart, N. J., Powers, A. C. Use of human islets to understand islet biology and diabetes: Progress, challenges and suggestions. Diabetologia. 62 (2), 212-222 (2019).
- Henquin, J. C. The challenge of correctly reporting hormones content and secretion in isolated human islets. Mol Metab. 30, 230-239 (2019).
- Panzer, J. K., Caicedo, A. Protocol to generate and utilize pancreatic tissue slices to study endocrine and exocrine physiology in situ from mouse and human tissue. STAR Protoc. 4 (3), 102399 (2023).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34 (3), 826-827 (2002).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by tpc2-dependent ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic alpha-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), e78706 (2013).
- Gal, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Front Physiol. 10, 938 (2019).
