Summary
Este protocolo descreve como gerar fatias de pâncreas humano de doadores de órgãos falecidos para estudar a função celular em condições quase fisiológicas. Essa abordagem inovadora permite a investigação de ilhotas normais e estruturalmente danificadas e a intrincada interação entre os compartimentos endócrino e exócrino.
Abstract
É crucial estudar o pâncreas humano para entender os mecanismos fisiopatológicos associados ao diabetes tipo 1 (DM1) e 2 (DM2), bem como a fisiologia e interação endócrina e exócrina do pâncreas. Muito foi aprendido com o estudo de ilhotas pancreáticas isoladas, mas isso impede o exame de sua função e interações no contexto de todo o tecido. As fatias do pâncreas oferecem uma oportunidade única de explorar a fisiologia de ilhotas normais, inflamadas e estruturalmente danificadas em seu ambiente nativo, permitindo o estudo das interações entre os compartimentos endócrinos e exócrinos para investigar melhor a dinâmica complexa do tecido pancreático. Assim, a adoção da plataforma de fatia de pâncreas vivo representa um avanço significativo no campo. Este protocolo descreve como gerar fatias de tecido vivo de doadores de órgãos falecidos por incorporação de tecido em fatiamento de agarose e vibrato, bem como sua utilização para avaliar leituras funcionais, como secreção dinâmica e imagens de células vivas.
Introduction
Estudos sobre a fisiologia das ilhotas são fundamentais para a compreensão da patogênese do diabetes e desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Até agora, a pesquisa se baseou em ilhotas isoladas, o que expõe as ilhotas a tensões mecânicas e enzimáticas, provavelmente causando mudanças na fisiologia celular; Além disso, não é possível avaliar a função das ilhotas no contexto de seu ambiente tecidual natural, que provavelmente é impactado por células exócrinas e vasculares, entre outras1. Ao estudar o pâncreas de doadores com DM1, há o desafio de que suas ilhotas são difíceis de isolar e podem se fragmentar durante o isolamento, o que pode produzir um efeito de seleção em ilhotas que podem não representar a população in vivo2. Além disso, as ilhotas serão separadas de seu ambiente complexo e conexões celulares, especialmente das células imunes infiltrantes que são encontradas em ilhotas inflamadas e são mais abundantes na periferia das ilhotas. Assim, embora ilhotas isoladas sejam uma ferramenta fundamental na pesquisa do diabetes, existem limitações. Em resposta, introduzimos um protocolo inovador para gerar fatias vivas de pâncreas, oferecendo uma solução para esses desafios.
O recente desenvolvimento e adoção de técnicas de fatiamento de tecido pancreático é considerado um avanço para nossa capacidade de explorar a intrincada biologia e funções do pâncreas. Essa inovação abriu novos caminhos para estudos dinâmicos da fisiologia das ilhotas e interações entre células endócrinas, exócrinas, neurais, vasculares e imunes dentro de seu contexto anatômico natural. Ao contrário das abordagens convencionais, esse cenário in vitro preserva grande parte da citoarquitetura do órgão, permitindo uma aproximação mais próxima de sua biologia nativa. Inicialmente desenvolvido em camundongos por Speier e Rupnik em 20033, este método demonstrou sua utilidade para avaliar imagens de cálcio, eletrofisiologia e secreção hormonal para sinalização intra e intercelular 4,5,6,7,8,9. A plataforma de corte de pâncreas foi então aplicada ao estudo do tecido pancreático humano obtido por biópsia cirúrgica 4,10,11,12. Nosso grupo demonstrou a viabilidade de obtenção e utilização de fatias de pâncreas de doadores de órgãos de cadáveres por meio da atividade da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD)13. O nPOD fornece tecidos do pâncreas para investigadores aprovados que conduzem pesquisas sobre diabetes tipo 1 humano e, desde a adoção da plataforma de fatias do pâncreas, o nPOD rotineiramente gera e distribui fatias vivas do pâncreas 14,15,16,17. Desde a implementação da plataforma de fatias de pâncreas em 2020, o nPOD distribuiu com sucesso fatias de tecido de 43 doadores (incluindo 12 doadores com DM1) para vários investigadores. Usando essas fatias, os pesquisadores realizaram pesquisas inovadoras sobre aspectos críticos da função das ilhotas e exploraram a interação entre as ilhotas e a vasculatura, o sistema nervoso e as células imunológicas no contexto do DM113 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. Numerosos estudos destacaram as limitações das abordagens tradicionais e ressaltaram a importância de técnicas que podem capturar a interação dinâmica dentro do pâncreas 25,26,27. A adaptabilidade das técnicas de fatiamento do pâncreas de camundongo ao pâncreas humano, juntamente com sua integração em programas como a Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD), exemplifica o crescente reconhecimento do potencial do método para desbloquear informações valiosas sobre doenças como diabetes tipo 1.
Protocol
Cortes pancreáticos humanos de doadores de tecidos de ambos os sexos foram obtidos por meio do banco de tecidos da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD) da Universidade da Flórida. O tecido de órgãos de indivíduos falecidos sem identificadores foi determinado como pesquisa em seres não humanos de acordo com as leis e regulamentos de doação de órgãos e classificado como Sujeitos Não Humanos pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Flórida (IRB; IRB nº 392-2008), dispensando a necessidade de consentimento. Os tecidos nPOD usados especificamente para este projeto foram aprovados como não humanos pelo IRB da Universidade da Flórida (IRB20140093).
NOTA: Para leitores totalmente novos na técnica de corte e suas aplicações, como perifusão e imagens de cálcio, pode ser aconselhável ganhar experiência prática e desenvolver habilidades básicas usando fatias de camundongos ou ratos 3,28 antes de trabalhar com amostras humanas.
1. Preparativos
NOTA: Essas preparações devem ser realizadas antes da chegada do tecido.
- Prepare o tampão HEPES misturando 125 mM de NaCl, 5,9 mM de KCl, 2,56 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 25 mM de HEPES, 0,1% de BSA, 2 mM de L-alanina, L-arginina e L-glutamina. Ajuste o pH para 7,4 e filtre a esterilização.
- Adicione glicose e/ou outros estímulos ao tampão para preparar soluções para o experimento de perifusão. Para tampão basal, adicione 5,5 mM de glicose. Este tampão será usado para procedimentos de fatiamento, coleta de fatias e preparações de perifusão.
- Prepare pelo menos dois pratos para coleta de fatias adicionando aprotinina (10 μg / mL) ao tampão basal.
- Preparar solução de agarose a 3,8 % de baixo ponto de fusão em tampão HEPES sem BSA e aminoácidos (NaCl 125 mM, KCl 5,9 mM, CaCl 2,56 mM2, MgCl2 1 mM, HEPES 25 mM) e mantê-la a 37 °C.
- Monte o vibratoma, colocando uma lâmina nova no suporte. Se aplicável, defina o ângulo da lâmina para 15° (se estiver usando Leica VT1200S). Se aplicável, calibre o vibratome.
- Ligue a máquina de perifusão, selecione o número de câmaras e o protocolo do programa.
- Coloque todas as soluções necessárias na máquina de perifusão, prepare o sistema e mantenha as soluções aquecidas. A máquina calcula os volumes necessários de cada solução usada para o protocolo.
2. Processamento de tecidos
NOTA: As fatias devem ser geradas imediatamente após o recebimento. Qualquer atraso pode causar dificuldades no procedimento e levar à degradação do tecido.
- Coloque o tecido do pâncreas em um prato com tampão de linha de base sob um microscópio estéreo (Figura 1A). Remova suavemente os tecidos conjuntivo, fibrótico e adiposo usando uma pinça e uma tesoura.
- Corte o tecido em vários pedaços pequenos de aproximadamente 0,5 cm3 (Figura 1B) usando uma tesoura ou bisturi. Seque os pedaços secos do pâncreas em papel de seda.
- Transfira 4 pedaços para uma placa de Petri de 35 mm e encha o prato com solução de agarose até que todos os pedaços estejam totalmente submersos. Deixe a agarose solidificar completamente.
- Corte cuidadosamente os pedaços da agarose. Passe o bisturi ao longo da borda do prato para remover a agarose e separe cuidadosamente os blocos de tecido. Certifique-se de que as peças estejam cercadas por uma fina camada de agarose.
3. Fatiamento
- Cole pedaços de tecido na placa de metal do vibratomo colocando-os de cabeça para baixo.
- Monte a placa na bandeja e encha a bandeja com tampão basal (HEPES contendo 5,5 mM de glicose basal).
- Defina o vibratomo para fatiamento automatizado a 120 μm e ajuste a posição inicial e final.
- Mova a lâmina um pouco acima do tecido e comece a cortar em velocidade lenta (0.1 mm/s) e amplitude de 0.8 mm. A velocidade pode ser aumentada se o tecido permitir (Figura 1C).
- Colete fatias usando uma pinça curva ou um pincel pequeno. Acumule fatias no tampão basal contendo aprotinina (Figura 1D).
- Deixe as fatias descansarem por pelo menos 1 h em tampão basal com aprotinina. Coloque as fatias em um agitador orbital lento para permitir a lavagem das enzimas liberadas pelo procedimento de corte.
4. Ensaio vivo/morto
NOTA: Este é um ensaio opcional que mostrará a viabilidade das fatias de tecido após o procedimento. No entanto, as fatias não podem ser reutilizadas depois de manchadas.
- Transfira uma única fatia em um poço preenchido com tampão de linha de base.
- Adicione diacetato de fluoresceína (FDA, 50 μg/mL), incube por 1 min em temperatura ambiente e proteja da luz.
- Adicione iodeto de propídio (PI, 50 μg / mL), incube por 1 min em temperatura ambiente e proteja da luz.
- Transfira a fatia para outro poço cheio de PBS para lavar por 1 min.
- Transfira as fatias para uma placa de Petri ou monte em uma lâmina de vidro com lamínula para imagem (Figura 2A, B).
5. Perifusão
NOTA: Este protocolo descreve como realizar a perifusão dinâmica para fatias de tecido, porém também é adequado para ilhotas isoladas. As câmaras das ilhotas precisarão ser preparadas com papel de filtro e solução de esferas antes de carregar as ilhotas, conforme descrito no manual do usuário da máquina. No entanto, ilhotas e câmaras de fatias podem ser usadas juntas no mesmo experimento.
- Escolha 3 fatias e corte a agarose ao mínimo em um estereomicroscópio usando pincel e bisturi.
- Adicione uma gota de tampão basal (HEPES contendo 5,5 mM de glicose basal) na grade da câmara de fatia e coloque suavemente uma fatia na grade. Repita para cada uma das 3 fatias (Figura 3A). Se as fatias forem muito pequenas, empilhe mais de 3 câmaras para aumentar a contagem de ilhotas. Não coloque mais de uma fatia por câmara.
NOTA: O número de ilhotas por fatia varia muito entre os doadores e depende do tamanho da fatia (10-100 ilhotas / fatia). Um total de 3 fatias provou ser suficiente para medir a secreção de insulina e glucagon. - Para ilhotas isoladas, use um mínimo de 30 ilhotas por coluna para secreção de insulina. Recomenda-se o uso de 100 ilhotas para detecção de glucagon. Monte as peças individuais da câmara de fatia de cima para baixo.
- Conecte a câmara de fatia às tubulações de entrada e saída da máquina e inicie o protocolo (Figura 3C).
- Use o aquecimento da câmara e a bomba de resfriamento da bandeja durante o protocolo. Mudar as placas de colheita durante o protocolo e conservar a 4 °C se a quantificação for realizada no mesmo dia ou conservar a -80 °C até essa data.
- Quando o protocolo estiver concluído, remova as câmaras, desmonte e colete as fatias para lise (HCl a 3% em etanol absoluto) ou fixação (em paraformaldeído a 4%).
- Limpe a máquina lavando-a com água, 10% de água sanitária, água e ar.
- Quantifique a secreção hormonal usando kits de detecção disponíveis comercialmente.
NOTA: A Figura 4 mostra os níveis absolutos de secreção de insulina e glucagon de 3 cortes para estimar as faixas de concentração.
6. Imagem de cálcio
- Prepare a solução de corante de cálcio (por exemplo, Fluo4-AM, Calbryte) de acordo com as instruções do fabricante.
- Dilua o corante na solução tampão HEPES basal e adicione aprotinina (10 μg / mL).
- Transfira uma única fatia e incube por 30-60 min em um agitador orbital em temperatura ambiente e proteja da luz.
- Durante o tempo de incubação, prepare a configuração da imagem de corte enchendo as seringas de perifusão e preparando os tubos (Figura 5A, B).
- Conecte todos os dispositivos, ligue o aquecedor e inicie o fluxo da bomba. Recomendado usar aquecimento em fluxo e aquecedor de plataforma e vazão de 0,5 mL/min.
- Coloque delicadamente uma única fatia na câmara de imagem e prenda usando uma harpa.
- Use uma objetiva de baixa ampliação para identificar a área de imagem. O uso da reflexão ajuda a identificar a área das ilhotas (Figura 5C).
- Mude para uma objetiva de ampliação mais alta (por exemplo, 20x ou 40x) e ajuste a posição de acordo com a configuração experimental.
NOTA: Para garantir a viabilidade celular ideal e a integridade das ilhotas, recomenda-se que as seções ópticas estejam 1-2 camadas de células abaixo da superfície de corte. - Defina a posição de varredura da pilha z e/ou do bloco. Defina o intervalo de imagem e a duração da gravação. Aqui, uma resolução de pelo menos 256 x 256 foi usada para permitir a discriminação de células individuais, um intervalo de imagem de 5-10 s e uma faixa de pilha z (se aplicável) de 30-60 μm com um intervalo de 10 μm entre os planos (uma camada de célula). Consulte a Figura 6 para obter configurações detalhadas de imagem.
NOTA: Defina o parâmetro de imagem para obter a melhor resolução e área máxima, mas evite branquear a amostra. - Inicie a aquisição de imagens e alterne o fluxo de entrada da solução de acordo com o experimento. Uma vez feito isso, colete fatias e fixe-as para imuno-histoquímica.
Representative Results
Quando o protocolo é executado com sucesso, 1 g de tecido pancreático produz aproximadamente 100-200 fatias. Posteriormente, esses cortes devem ser submetidos à inspeção estereoscópica para identificar aqueles ricos em ilhotas antes de prosseguir com as avaliações funcionais. A viabilidade, determinada pela marcação com Diacetato de Fluoresceína (FDA) e Iodeto de Propídio (PI), deve atingir 80%-90% (Figura 2A). A viabilidade pode ser notavelmente menor na superfície de corte devido a danos celulares durante o processo de fatiamento. Em fatias viáveis, observa-se secreção dinâmica de hormônio (Figura 2B), resultando em liberação robusta de insulina após exposição a glicose elevada e despolarização da membrana com cloreto de potássio (KCl).
Por outro lado, quando há atrasos durante o procedimento de fatiamento ou a qualidade do tecido é abaixo do ideal, os resultados diferem significativamente. O número de fatias obtidas pode diminuir, e a avaliação da viabilidade pode indicar uma proporção maior de células não viáveis marcadas com IP (Figura 2C). Nesses casos, a avaliação funcional indica uma resposta diminuída ou mesmo ausente à glicose elevada e à despolarização da membrana (Figura 2D). Os dados de experimentos abaixo do ideal ilustram a importância da execução precisa em tempo hábil e da qualidade do tecido, pois podem levar à redução da viabilidade do tecido e à funcionalidade prejudicada. Esses resultados negativos servem como um lembrete valioso dos fatores críticos a serem considerados no sucesso desse método.
Achados comuns em imagens de cálcio são visualizados como um mapa de calor, conforme ilustrado na Figura 5D, ou como traços separados para células individuais, conforme apresentado na Figura 5E. É importante enfatizar que o corante rotula todos os tipos de células indiscriminadamente, portanto, estímulos específicos são essenciais para distinguir as células com base em suas respostas. Para identificar células viáveis, empregamos KCl e classificamos as células com base nas respostas que excedem a resposta média da linha de base em mais de dois erros padrão. Além disso, as fatias podem ser fixadas e coradas, permitindo a identificação dos tipos de células.
Figura 1: Processamento e fatiamento de tecidos. (A) 1 g de tecido pancreático não processado. (B) Pedaços de pâncreas limpos prontos para incorporação de agarose. (C) Procedimento de fatiamento usando um vibratome. (D) Fatias de pâncreas humano recém-cortadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dados de viabilidade tecidual e secreção de insulina. (A) Imagens representativas para fatias de tecido viáveis. Projeção de intensidade máxima da luz laser refletida (cinza, canto superior esquerdo), PI para células mortas (vermelho, canto inferior esquerdo), FDA para células vivas (verde, canto inferior direito) e imagens mescladas para células vivas e mortas (canto superior direito). A linha pontilhada indica uma ilhota. Barra de escala 50 μm. (B) Secreção dinâmica de insulina de fatias de tecido pancreático humano de um único doador não diabético. A cinética da insulina mostra uma resposta de pico da primeira fase após 6 min de estimulação com glicose alta, seguida por uma segunda fase de platô. Os dados são normalizados para a secreção basal média a 5,5 mM de glicose (índice de estimulação, mudança de dobra). A secreção foi realizada em fatias do mesmo doador, conforme mostrado em (A). (C) Imagens representativas para fatias de tecido não viáveis. Projeção de intensidade máxima da luz laser refletida (cinza, canto superior esquerdo), PI para células mortas (vermelho, canto inferior esquerdo), FDA para células vivas (verde, canto inferior direito) e imagens mescladas para células vivas e mortas (canto superior direito). A linha pontilhada indica uma ilhota. Barra de escala 50 μm. (D) Secreção dinâmica de insulina de fatias de tecido pancreático humano de um único doador não diabético. A cinética da insulina demonstra uma clara perda de secreção de insulina estimulada por glicose e despolarização da membrana com KCl. Os dados são normalizados para a secreção basal média a 5,5 mM de glicose (índice de estimulação, mudança de dobra). A secreção foi realizada em fatias do mesmo doador, conforme mostrado em (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Carga tecidual para perifusão dinâmica. (A) Câmaras de corte empilhadas. Fatias individuais são carregadas em uma grade de metal, conforme mostrado na inserção. (B) Carregamento de ilhotas isoladas em câmaras de ilhotas. Câmaras de fatias e ilhotas conectadas à máquina de perifusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Secreção hormonal em fatias e ilhotas isoladas. Os dados apresentados nos painéis (A) e (B) são provenientes de um doador diferente em comparação com os painéis (C) e (D). (A) Secreção hormonal absoluta de 3 fatias de tecido pancreático de um único doador não diabético. A secreção de insulina é mostrada em verde e a secreção de glucagon em magenta. (B) Secreção hormonal mostrada em (A) normalizada para o conteúdo hormonal total (% do conteúdo). O conteúdo é medido a partir de todas as 3 fatias usadas no experimento. (C) Secreção dinâmica de insulina de ilhotas isoladas (100 ilhotas) e fatias de tecido pancreático (3 fatias) do mesmo doador não diabético. Os dados são mostrados em números absolutos (mU/L). (D) Secreção de insulina mostrada em (C) normalizada para o conteúdo total de insulina (% do conteúdo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Configuração de imagem e resultados esperados. (A) Configuração para imagem funcional com um microscópio confocal vertical e uma configuração de perifusão. (B) Câmara de imagem conectada ao fluxo de entrada e saída. (C) Pilha Z de imagens confocais de uma ilhota dentro de uma fatia de tecido de um doador humano saudável mostrando luz refletida (superior) e sinal Fluo4 (inferior). A reflexão é usada para identificar ilhotas dentro da fatia (linha pontilhada). (D) Mapa de calor mostrando in vitro a dinâmica de Ca2+ de células de ilhotas expressas como a intensidade fluorescente de Fluo4 normalizada para a intensidade do sinal basal a 5,5 mM de glicose e estimulação com glicose alta (16,7 mM). Cada linha representa uma única célula seguida ao longo do tempo no eixo x e sua resposta na mudança de magnitude (%) da intensidade fluorescente sobre a linha de base (dF/F) mostrada na escala de cores de azul (baixa intensidade) a vermelho (alta intensidade). (E) Traços representativos de 4 células individuais mostrando uma resposta à glicose alta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Configurações de imagem de cálcio. Captura de tela do software de configurações representativas escolhidas para realizar gravações de lapso de tempo de 40 μm (imagem XYZT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aqui apresentamos um protocolo para gerar fatias de tecido pancreático viáveis e seu uso para leituras funcionais como secreção hormonal dinâmica e imagem funcional. Semelhante ao isolamento das ilhotas humanas, o sucesso do procedimento de corte é influenciado por vários fatores, incluindo características do doador, tempo de envio do tecido e qualidade do tecido25,29. Portanto, é crucial selecionar cuidadosamente amostras de tecido para o experimento e manter os tempos de isquemia no mínimo. Nesse contexto, outras fontes potenciais de tecido humano além dos doadores cadáveres devem ser cuidadosamente consideradas. A inclusão de doadores cirúrgicos oferece a opção de combinar dados de cortes funcionais com informações in vivo relevantes do mesmo paciente, fortalecendo a relevância translacional11. No entanto, essa fonte de tecido traz outros fatores, pois as biópsias geralmente são de pacientes mais velhos submetidos à pancreatectomia, principalmente devido a um tumor localizado. Notavelmente, as biópsias do pâncreas não são realizadas no contexto do diabetes.
Ao realizar o procedimento de fatiamento real, o processamento oportuno do tecido é fundamental. As fatias podem ser armazenadas por várias horas, conforme descrito neste protocolo, ou cultivadas por longos períodos, conforme descrito por Qadir et al.19. Atualmente, este protocolo é o único método para sustentar a viabilidade do slice por períodos prolongados, no entanto, esforços futuros devem avaliar as mudanças funcionais em diversos tempos de cultivo e fazer comparações com ilhotas isoladas, do mesmo doador.
A etapa mais crítica do processo é a preparação cuidadosa do tecido antes de incorporá-lo à agarose. Grandes ductos e tecido fibrótico podem complicar o processo de corte e potencialmente levar à quebra de blocos de tecido da agarose. Se isso ocorrer e as peças permanecerem de tamanho razoável, elas podem ser reprocessadas e incorporadas para fatiamento. Manter a boa qualidade do tecido e o processamento cuidadoso aumentam muito a eficiência do procedimento de fatiamento e produzem a quantidade e a qualidade máximas de fatias. O tempo decorrido desde a preparação do tecido até a geração do corte não deve exceder 2-3 h, pois intervalos mais longos afetam significativamente a viabilidade do tecido.
Durante a perifusão do corte, uma etapa simples, mas crítica, é o corte preciso do corte para garantir um ajuste perfeito na câmara. Isso permite o banho adequado do tecido e o fluxo ininterrupto. Uma vez iniciado o protocolo, é essencial evitar mais manipulações das câmaras para evitar picos indesejados na liberação de hormônios. Um tampão suficiente deve ser preparado e a tubulação deve atingir o fundo da solução para evitar a sucção do ar e as câmaras secarem.
Para imagens de cálcio, é importante escolher cuidadosamente a área de interesse, dependendo das necessidades experimentais e do projeto. É importante minimizar o fotobranqueamento escolhendo parâmetros de imagem que reduzam a exposição à luz ou encurtem o tempo geral do protocolo. Assim como a secreção hormonal dinâmica, é crucial manter o fluxo adequado da solução e uma configuração aquecida, pois as fatias requerem condições quase fisiológicas para uma função ideal (por exemplo, 37 °C).
As fatias de tecido pancreático mantêm efetivamente a integridade estrutural do pâncreas, preservando as conexões célula-célula entre seus diversos tipos de células. Consequentemente, eles fornecem uma alternativa ao trabalho com ilhotas isoladas, facilitando a exploração simultânea de funções endócrinas e exócrinas e sua interação. Para avaliar a interação de tipos de células individuais, é crucial discriminá-los. A coloração posterior é uma opção, mas tem limitações em termos de sondas fluorescentes disponíveis e o desafio de localizar camadas celulares exatas. Portanto, é aconselhável incorporar estímulos específicos da célula no protocolo para permitir a discriminação celular com base nas respostas. Para discriminar entre tipos de células em fatias de camundongos ou humanos, estímulos eficazes incluem adrenalina para células alfa21,30, grelina para células delta31, ceruleína para células acinares 5,32, ácidos biliares para células ductais33 e norepinefrina para células vasculares22. Estímulos semelhantes podem ser empregados para medir as respostas secretoras. Enquanto os estudos de imagem se concentram em células individuais, os estudos de secreção analisam a resposta coletiva. Portanto, é crucial incluir um amplo número de fatias para detectar os resultados desejados. A quantidade ideal pode variar entre os tipos de células, com três fatias provando ser suficientes para as células endócrinas; no entanto, é aconselhável usar mais fatias para garantir a detectabilidade, em vez de correr o risco de perder informações valiosas.
Como qualquer outro método, os cortes de tecido têm limitações que devem ser consideradas na interpretação dos resultados. A aplicação de estímulo direcionada a tipos de células específicas pode levar a efeitos em outros tipos de células na fatia, potencialmente desencadeando ciclos de feedback. No entanto, esses também são importantes para estudar e, portanto, as respostas medidas podem ser mais representativas de uma resposta fisiológica. Para o direcionamento seletivo de células, protocolos tradicionais in vitro podem ser usados. É importante ressaltar que as células acinares contêm enzimas pancreáticas que podem quebrar proteínas e digerir a fatia do tecido, resultando em degradação celular em questão de horas. Para manter a viabilidade, o uso consistente de inibidores de tripsina é essencial quando as fatias estão em estado estático, mesmo que sua aplicação possa interferir na transferência bem-sucedida de vírus empregados para fins de rotulagem.
Em comparação com o isolamento das ilhotas, a variabilidade do doador e a qualidade do tecido podem afetar tanto a quantidade quanto a viabilidade das fatias obtidas. A viabilidade insuficiente pós-fatiamento pode resultar em uma vida útil curta e prejudicar a capacidade de cultivar as fatias. Além disso, a contagem de ilhotas pode variar significativamente entre os doadores, tornando difícil estimar o conteúdo das ilhotas antes de realizar experimentos. Consequentemente, a seleção cuidadosa dos critérios de aceitação do doador e a implementação de métodos de normalização apropriados, como a porcentagem de conteúdo hormonal para secreção ou mudança de dobra para a linha de base, são cruciais. Para resultados consistentes, é aconselhável avaliar a viabilidade do corte de tecido antes do experimento. Além disso, recomenda-se a incorporação de estímulos de controle relevantes (por exemplo, KCl) no experimento. Em casos de análise celular individual, como imagens, pode ser implementada a pré-classificação de células com base em sua resposta a esses estímulos de controle. Apesar dos desafios mencionados, as fatias oferecem um aumento valioso aos métodos de pesquisa atuais.
O protocolo descrito pode ser usado como ponto de partida para várias aplicações, e as fatias do pâncreas podem ser manipuladas e as respostas examinadas após uma variedade de estímulos. Também direcionamos os leitores para vários estudos de pesquisa utilizando fatias de pâncreas de camundongos ou humanos, fornecendo informações valiosas para aqueles que planejam seus experimentos. No futuro, é possível que terapias potenciais possam ser investigadas usando fatias pancreáticas ou que os mecanismos da doença possam ser modelados.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi realizada com o apoio da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), um projeto colaborativo de pesquisa de diabetes tipo 1 apoiado pela JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). O conteúdo e as opiniões expressas são de responsabilidade dos autores e não refletem necessariamente a visão oficial do nPOD. As Organizações de Aquisição de Órgãos (OPO) em parceria com o nPOD para fornecer recursos de pesquisa estão listadas em http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Os autores são gratos aos doadores e suas famílias por sua inestimável contribuição. Este trabalho foi apoiado pela American Diabetes Association 4-22-PDFPM (J.K.P.) e pelo Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (concessão 2015-PG-T1D-052).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
| AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
| AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
| AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
| Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
| Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
| Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
| Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
| Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
| Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
| Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
| Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
| Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
| Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
| Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
| Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
| Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |
References
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