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Biology

Generación de cortes de tejido pancreático humano para estudiar la fisiología endocrina y exocrina del páncreas

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66468
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Diabetes Immunology, Arthur Riggs Diabetes and Metabolism Research Institute

Summary

Este protocolo describe cómo generar cortes de páncreas humano a partir de donantes de órganos fallecidos para estudiar la función celular en condiciones casi fisiológicas. Este enfoque innovador permite la investigación de islotes normales y estructuralmente dañados y la intrincada interacción entre los compartimentos endocrinos y exocrinos.

Abstract

Es crucial estudiar el páncreas humano para comprender los mecanismos fisiopatológicos asociados con la diabetes tipo 1 (DT1) y 2 (DT2), así como la fisiología y la interacción endocrina y exocrina del páncreas. Se ha aprendido mucho del estudio de los islotes pancreáticos aislados, pero esto impide examinar su función e interacciones en el contexto de todo el tejido. Los cortes de páncreas brindan una oportunidad única para explorar la fisiología de los islotes normales, inflamados y estructuralmente dañados dentro de su entorno nativo, lo que a su vez permite el estudio de las interacciones entre los compartimentos endocrino y exocrino para investigar mejor la compleja dinámica del tejido pancreático. Por lo tanto, la adopción de la plataforma de corte de páncreas vivo representa un avance significativo en el campo. Este protocolo describe cómo generar cortes de tejido vivo a partir de donantes de órganos fallecidos mediante la inclusión de tejido en cortes de agarosa y vibratome, así como su utilización para evaluar lecturas funcionales como la secreción dinámica y la obtención de imágenes de células vivas.

Introduction

Los estudios sobre la fisiología de los islotes son fundamentales para comprender la patogénesis de la diabetes y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. Hasta ahora, la investigación se ha basado en islotes aislados, lo que expone a los islotes a tensiones mecánicas y enzimáticas, lo que probablemente cause cambios en la fisiología celular; Además, no es posible evaluar la función de los islotes en el contexto de su entorno tisular natural, que probablemente se vea afectado por las células exocrinas y vasculares, entre otras1. Cuando se estudia el páncreas de donantes con DT1, existe el desafío de que sus islotes son difíciles de aislar y pueden fragmentarse durante el aislamiento, lo que podría producir un efecto de selección en islotes que pueden no representar a la población in vivo2. Además, los islotes se separarán de su complejo entorno y conexiones celulares, especialmente de las células inmunitarias infiltrantes que se encuentran en los islotes inflamados y son más abundantes en la periferia de los islotes. Por lo tanto, si bien los islotes aislados son una herramienta fundamental en la investigación de la diabetes, existen limitaciones. En respuesta, presentamos un protocolo innovador para generar cortes de páncreas vivo, que ofrece una solución a estos desafíos.

El reciente desarrollo y adopción de técnicas de corte de tejido pancreático se considera un gran avance para nuestra capacidad de explorar la intrincada biología y las funciones del páncreas. Esta innovación ha abierto nuevas vías para estudios dinámicos de la fisiología de los islotes y las interacciones entre las células endocrinas, exocrinas, neurales, vasculares e inmunitarias dentro de su contexto anatómico natural. A diferencia de los enfoques convencionales, este entorno in vitro conserva gran parte de la citoarquitectura del órgano, lo que permite una aproximación más cercana a su biología nativa. Desarrollado inicialmente en ratones por Speier y Rupnik en 20033, este método ha demostrado su utilidad para evaluar las imágenes de calcio, la electrofisiología y la secreción de hormonas para la señalización intra e intercelular 4,5,6,7,8,9. A continuación, se aplicó la plataforma de corte de páncreas al estudio del tejido de páncreas humano obtenido mediante biopsia quirúrgica 4,10,11,12. Nuestro grupo demostró la factibilidad de obtener y utilizar cortes de páncreas de donantes de órganos cadavéricos a través de la actividad de la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD)13. nPOD proporciona tejidos de páncreas a investigadores aprobados que realizan investigaciones sobre la diabetes tipo 1 en humanos, y desde que adoptó la plataforma de cortes de páncreas, nPOD genera y distribuye rutinariamente cortes de páncreas vivos 14,15,16,17. Desde la implementación de la plataforma de cortes de páncreas en 2020, nPOD ha distribuido con éxito cortes de tejido de 43 donantes (incluidos 12 donantes con diabetes tipo 1) a numerosos investigadores. Con estos cortes, los investigadores realizaron investigaciones pioneras sobre aspectos críticos de la función de los islotes y exploraron la interacción entre los islotes y la vasculatura, el sistema nervioso y las células inmunitarias en el contexto de la diabetes tipo 13,18,19,20,21,22,23,24. Numerosos estudios han puesto de relieve las limitaciones de los enfoques tradicionales y han subrayado la importancia de las técnicas que pueden captar la interacción dinámica dentro del páncreas 25,26,27. La adaptabilidad de las técnicas de corte del páncreas de ratón al humano, junto con su integración en programas como la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD), ejemplifica el creciente reconocimiento del potencial del método para desbloquear información valiosa sobre enfermedades como la diabetes tipo 1.

Protocol

Las secciones pancreáticas humanas de donantes de tejido de ambos sexos se obtuvieron a través del banco de tejidos de la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD) de la Universidad de Florida. Se ha determinado que el tejido de órganos de personas fallecidas sin identificadores es una investigación de sujetos no humanos de acuerdo con las leyes y regulaciones de donación de órganos y se ha clasificado como Sujetos No Humanos por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Florida (IRB; IRB nº 392-2008), renunciando a la necesidad de consentimiento. Los tejidos nPOD utilizados específicamente para este proyecto fueron aprobados como no humanos por el IRB (IRB20140093 de la Universidad de Florida.

NOTA: Para los lectores completamente nuevos en la técnica de corte y sus aplicaciones, como la perifusión y la obtención de imágenes de calcio, podría ser aconsejable adquirir experiencia práctica y desarrollar habilidades básicas utilizando cortes de ratón o rata 3,28 antes de trabajar con muestras humanas.

1. Preparativos

NOTA: Estas preparaciones deben realizarse antes de la llegada del tejido.

  1. Prepare el tampón HEPES mezclando 125 mM de NaCl, 5,9 mM de KCl, 2,56 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 25 mM de HEPES, 0,1% de BSA, 2 mM de L-alanina, L-arginina y L-glutamina. Ajuste el pH a 7,4 y filtre la esterilización.
  2. Agregue glucosa u otros estímulos al tampón para preparar soluciones para el experimento de perifusión. Para el tampón de referencia, agregue 5,5 mM de glucosa. Este tampón se utilizará para los procedimientos de corte, la recolección de cortes y las preparaciones de perifusión.
  3. Prepare al menos dos platos para la recolección de rebanadas agregando aprotinina (10 μg/mL) al tampón de referencia.
  4. Preparar una solución de agarosa al 3,8 % de bajo punto de fusión en tampón HEPES sin BSA ni aminoácidos (125 mM de NaCl, 5,9 mM de KCl, 2,56 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 25 mM de HEPES) y mantenerla a 37 °C.
  5. Ensamble el vibratomo, colocando una cuchilla nueva en el soporte. Si corresponde, ajuste el ángulo de la hoja a 15° (si usa Leica VT1200S). Si corresponde, calibre el vibrátomo.
  6. Encienda la máquina de perifusión, seleccione el número de cámaras y el protocolo del programa.
  7. Coloque todas las soluciones necesarias en la máquina de perifusión, cebe el sistema y mantenga las soluciones calientes. La máquina calcula los volúmenes necesarios de cada solución utilizada para el protocolo.

2. Procesamiento de tejidos

NOTA: Las porciones deben generarse inmediatamente después de recibirlas. Cualquier retraso puede causar dificultades en el procedimiento y conducir a la degradación del tejido.

  1. Coloque el tejido del páncreas en una placa con tampón de referencia bajo un microscopio estereoscópico (Figura 1A). Retire suavemente los tejidos conectivos, fibróticos y adiposos con pinzas y tijeras.
  2. Corte el tejido en múltiples trozos pequeños de aproximadamente 0,5cm3 (Figura 1B) con unas tijeras o un bisturí. Seca los pedazos secos de páncreas en papel de seda.
  3. Transfiera 4 piezas a una placa de Petri de 35 mm y llene la placa con solución de agarosa hasta que todas las piezas estén completamente sumergidas. Deje que la agarosa se solidifique por completo.
  4. Corta con cuidado los trozos de la agarosa. Pasa el bisturí por el borde del plato para eliminar la agarosa y separa con cuidado los bloques de tejido. Asegúrese de que las piezas estén rodeadas por una capa delgada de agarosa.

3. Cortar en rodajas

  1. Pega los pedazos de tejido en la placa de metal del vibratomo colocándolos boca abajo.
  2. Monte la placa en la bandeja y llénela con tampón de referencia (HEPES que contiene 5,5 mM de glucosa de referencia).
  3. Ajuste el vibratome al corte automático a 120 μm y ajuste la posición inicial y final.
  4. Mueva la cuchilla brevemente por encima del tejido y comience a cortar a velocidad lenta (0,1 mm/s) y amplitud a 0,8 mm. La velocidad se puede aumentar si el tejido lo permite (Figura 1C).
  5. Recoja las rodajas con pinzas curvas o un cepillo pequeño. Acumule cortes en el tampón basal que contiene aprotinina (Figura 1D).
  6. Deje reposar las rodajas durante al menos 1 h en tampón basal con aprotinina. Coloque las rodajas en un agitador orbital lento para permitir la eliminación de las enzimas liberadas por el procedimiento de corte.

4. Ensayo de vivo/muerto

NOTA: Este es un ensayo opcional que mostrará la viabilidad de las rebanadas de tejido después del procedimiento. Sin embargo, las rodajas no se pueden reutilizar una vez manchadas.

  1. Transfiera una sola porción en un pozo lleno con búfer de línea base.
  2. Añadir diacetato de fluoresceína (FDA, 50 μg/mL), incubar durante 1 min a temperatura ambiente y proteger de la luz.
  3. Añadir yoduro de propidio (PI,50 μg/mL), incubar durante 1 min a temperatura ambiente y proteger de la luz.
  4. Transfiera la rebanada a otro pozo lleno de PBS para lavar durante 1 min.
  5. Transfiera las rodajas a una placa de Petri o móntelas en un portaobjetos de vidrio con cubreobjetos para obtener imágenes (Figura 2A, B).

5. Perifusión

NOTA: Este protocolo describe cómo realizar la perifusión dinámica para cortes de tejido, sin embargo, también es adecuado para islotes aislados. Las cámaras de los islotes deberán prepararse con papel de filtro y solución de perlas antes de cargar los islotes, como se describe en el manual del usuario de la máquina. Sin embargo, el islote y la cámara de corte se pueden usar juntos en el mismo experimento.

  1. Elija 3 rodajas y recorte la agarosa al mínimo bajo un microscopio estereoscópico con un cepillo y un bisturí.
  2. Añada una gota de tampón de referencia (HEPES que contenga 5,5 mM de glucosa de referencia) en la rejilla de la cámara de corte y coloque suavemente una rebanada en la rejilla. Repita para cada una de las 3 rebanadas (Figura 3A). Si las porciones son muy pequeñas, apile más de 3 cámaras para aumentar el recuento de islotes. No coloque más de una rebanada por cámara.
    NOTA: El número de islotes por rebanada varía mucho entre los donantes y depende del tamaño de la rebanada (10-100 islotes/rebanada). Se ha demostrado que un total de 3 cortes son suficientes para medir la secreción de insulina y glucagón.
  3. En el caso de los islotes aislados, utilice un mínimo de 30 islotes por columna para la secreción de insulina. Se recomienda el uso de 100 islotes para la detección de glucagón. Ensamble las piezas individuales de la cámara de corte de arriba a abajo.
  4. Conecte la cámara de corte a los tubos de entrada y salida de la máquina e inicie el protocolo (Figura 3C).
  5. Utilice la bomba de calentamiento de la cámara y la bomba de enfriamiento de la bandeja durante el protocolo. Cambie las placas de recolección durante el protocolo y almacene a 4 °C si la cuantificación se realiza el mismo día o almacene a -80 °C hasta entonces.
  6. Una vez finalizado el protocolo, retire las cámaras, desmóntelas y recoja las rodajas para la lisis (3% de HCl en etanol absoluto) o la fijación (en 4% de paraformaldehído).
  7. Limpie la máquina enjuagándola con agua, lejía al 10%, agua y aire.
  8. Cuantifique la secreción de hormonas mediante el uso de kits de detección disponibles en el mercado.
    NOTA: La Figura 4 muestra los niveles absolutos de secreción de insulina y glucagón de 3 cortes para estimar los rangos de concentración.

6. Imágenes de calcio

  1. Prepare la solución de colorante de calcio (por ejemplo, Fluo4-AM, Calbryte) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Diluir el colorante en la solución tampón HEPES basal y añadir aprotinina (10 μg/mL).
  3. Transfiera una sola rebanada e incube durante 30-60 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente y protéjalo de la luz.
  4. Durante el tiempo de incubación, prepare la configuración de la imagen del corte llenando las jeringas de perifusión y cebando los tubos (Figura 5A, B).
  5. Conecte todos los dispositivos, encienda el calentador e inicie el flujo de la bomba. Se recomienda utilizar tanto la calefacción de flujo como el calentador de plataforma y un caudal de 0,5 mL/min.
  6. Coloque suavemente una sola rebanada en la cámara de imágenes y asegúrela con un arpa.
  7. Utilice un objetivo de aumento bajo para identificar el área de la imagen. El uso de la reflexión ayuda a identificar el área de los islotes (Figura 5C).
  8. Cambie a un objetivo de aumento más alto (por ejemplo, 20x o 40x) y ajuste la posición de acuerdo con la configuración experimental.
    NOTA: Para garantizar una viabilidad celular óptima y la integridad de los islotes, se recomienda que las secciones ópticas estén a 1-2 capas de celda por debajo de la superficie de corte.
  9. Establezca la pila z o la posición de escaneo de mosaicos. Establezca el intervalo de imagen y la duración de la grabación. En este caso, se utilizó una resolución de al menos 256 x 256 para permitir la discriminación de células individuales, un intervalo de imagen de 5-10 s y un rango de pila z (si corresponde) de 30-60 μm con un intervalo de 10 μm entre planos (una capa de celda). Consulte la Figura 6 para ver los ajustes detallados de las imágenes.
    NOTA: Configure el parámetro de imagen para obtener la mejor resolución y el área máxima, pero evite blanquear la muestra.
  10. Inicie la obtención de imágenes y cambie el flujo de entrada de la solución de acuerdo con el experimento. Una vez hecho esto, recoja las rodajas y fíjelas para la inmunohistoquímica.

Representative Results

Cuando el protocolo se ejecuta con éxito, 1 g de tejido de páncreas produce aproximadamente 100-200 cortes. Posteriormente, estos cortes deben someterse a una inspección estereoscópica para identificar aquellos ricos en islotes antes de proceder con las evaluaciones funcionales. Se espera que la viabilidad, determinada por el marcaje con diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI), alcance el 80%-90% (Figura 2A). La viabilidad puede ser notablemente menor en la superficie de corte debido al daño de las células durante el proceso de corte. En cortes viables, se observa una secreción dinámica de hormonas (Figura 2B), lo que resulta en una liberación robusta de insulina tras la exposición a alta glucosa y la despolarización de la membrana con cloruro de potasio (KCl).

Por el contrario, cuando hay retrasos durante el procedimiento de corte o la calidad del tejido no es óptima, los resultados difieren significativamente. El número de cortes obtenidos puede disminuir, y la evaluación de la viabilidad puede indicar una mayor proporción de células no viables marcadas con PI (Figura 2C). En estos casos, la evaluación funcional indica una respuesta disminuida o incluso ausente a la glucosa alta y a la despolarización de la membrana (Figura 2D). Los datos de experimentos subóptimos ilustran la importancia de una ejecución precisa de manera oportuna y de la calidad del tejido, ya que pueden reducir la viabilidad del tejido y deteriorar la funcionalidad. Estos resultados negativos sirven como un valioso recordatorio de los factores críticos a considerar en el éxito de este método.

Los hallazgos comunes en las imágenes de calcio se visualizan como un mapa de calor, como se muestra en la Figura 5D, o como trazas separadas para células individuales, como se presenta en la Figura 5E. Es importante destacar que el colorante marca todos los tipos de células indiscriminadamente, por lo que los estímulos específicos son esenciales para distinguir las células en función de sus respuestas. Para identificar las células viables, empleamos KCl y clasificamos las células en función de las respuestas que superan la respuesta basal media en más de dos errores estándar. Además, las rodajas se pueden fijar y teñir, lo que permite la identificación de los tipos de células.

Figure 1
Figura 1: Procesamiento y corte de tejidos. (A) 1 g de tejido de páncreas sin procesar. (B) Piezas de páncreas limpias listas para la inclusión de agarosa. (C) Procedimiento de corte con vibrátomo. (D) Cortes de páncreas humano recién cortados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Datos de viabilidad tisular y secreción de insulina. (A) Imágenes representativas de cortes de tejido viable. Proyección de máxima intensidad de luz láser reflejada (gris, arriba a la izquierda), PI para células muertas (rojo, abajo a la izquierda), FDA para células vivas (verde, abajo a la derecha) e imágenes combinadas para células vivas y muertas (arriba a la derecha). La línea punteada indica un islote. Barra de escala 50 μm. (B) Secreción dinámica de insulina de cortes de tejido pancreático humano de un solo donante no diabético. La cinética de la insulina muestra una respuesta máxima en la primera fase después de 6 minutos de estimulación con glucosa alta, seguida de una segunda fase de meseta. Los datos se normalizan a la secreción basal media a 5,5 mM de glucosa (índice de estimulación, cambio de pliegue). La secreción se ha realizado en rodajas del mismo donante, como se muestra en (A). (C) Imágenes representativas de cortes de tejido no viables. Proyección de máxima intensidad de luz láser reflejada (gris, arriba a la izquierda), PI para células muertas (rojo, abajo a la izquierda), FDA para células vivas (verde, abajo a la derecha) e imágenes combinadas para células vivas y muertas (arriba a la derecha). La línea punteada indica un islote. Barra de escala 50 μm. (D) Secreción dinámica de insulina de cortes de tejido pancreático humano de un solo donante no diabético. La cinética de la insulina demuestra una clara pérdida tanto de la secreción de insulina estimulada por la glucosa como de la despolarización de la membrana con KCl. Los datos se normalizan a la secreción basal promedio a 5,5 mM de glucosa (índice de estimulación, cambio de pliegue). La secreción se ha realizado en rodajas del mismo donante, como se muestra en (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Carga tisular para perifusión dinámica. (A) Cámaras de corte apiladas. Las lonchas individuales se cargan en una rejilla metálica como se muestra en el inserto. (B) Carga de islotes aislados en cámaras de islotes. Cámaras de corte e islotes conectadas a la máquina de perifusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Secreción de hormonas en rodajas e islotes aislados. Los datos que se muestran en los paneles (A) y (B) proceden de un donante diferente en comparación con los paneles (C) y (D). (A) Secreción absoluta de hormonas de 3 cortes de tejido pancreático de un solo donante no diabético. La secreción de insulina se muestra en verde y la secreción de glucagón en magenta. (B) La secreción de hormonas que se muestra en (A) normalizada al contenido total de hormonas (% del contenido). El contenido se mide a partir de las 3 porciones utilizadas en el experimento. (C) Secreción dinámica de insulina de islotes aislados (100 islotes) y cortes de tejido pancreático (3 cortes) del mismo donante no diabético. Los datos se muestran en números absolutos (mU/L). (D) La secreción de insulina que se muestra en (C) normalizada al contenido total de insulina (% del contenido). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Configuración de imágenes y resultados esperados. (A) Configuración para imágenes funcionales con un microscopio confocal vertical y una configuración de perifusión. (B) Cámara de imágenes conectada al flujo de entrada y salida. (C) Pila Z de imágenes confocales de un islote dentro de un corte de tejido de un donante humano sano que muestra luz reflejada (arriba) y señal Fluo4 (abajo). La reflexión se utiliza para identificar los islotes dentro de la rebanada (línea de puntos). (D) Mapa de calor que muestra in vitro la dinámica de Ca2+ de las células de los islotes expresada como la intensidad fluorescente de Fluo4 normalizada a la intensidad de la señal basal a 5,5 mM de glucosa y estimulación con glucosa alta (16,7 mM). Cada fila representa una sola célula seguida a lo largo del tiempo en el eje x y su respuesta en el cambio de magnitud (%) de la intensidad fluorescente sobre la línea de base (dF/F) que se muestra en la escala de colores de azul (baja intensidad) a rojo (alta intensidad). (E) Trazas representativas de 4 células individuales que muestran una respuesta a la glucosa alta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Configuración de las imágenes de calcio. Captura de pantalla del software de los ajustes representativos elegidos para realizar grabaciones time-lapse de 40 μm (imágenes XYZT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aquí presentamos un protocolo para generar cortes viables de tejido de páncreas y su uso para lecturas funcionales como la secreción dinámica de hormonas y la imagen funcional. Al igual que el aislamiento de islotes humanos, el éxito del procedimiento de corte está influenciado por varios factores, incluidas las características del donante, el tiempo de envío del tejido y la calidad del tejido25,29. Por lo tanto, es crucial seleccionar cuidadosamente las muestras de tejido para el experimento y mantener los tiempos de isquemia al mínimo. En este contexto, se deben considerar cuidadosamente otras fuentes potenciales de tejido humano además de los donantes cadavéricos. La inclusión de donantes quirúrgicos ofrece la opción de combinar datos de corte funcional con información in vivo relevante del mismo paciente, lo que refuerza la relevancia traslacional11. Sin embargo, esta fuente de tejido aporta otros factores, ya que las biopsias suelen ser de pacientes mayores que se someten a una pancreatectomía, en su mayoría debido a un tumor localizado. Cabe destacar que las biopsias de páncreas no se realizan en el contexto de la diabetes.

Al realizar el procedimiento de corte real, el procesamiento oportuno de los tejidos es fundamental. Los cortes pueden almacenarse durante varias horas, como se describe en este protocolo, o cultivarse durante períodos prolongados, como se describe en Qadir et al.19. En la actualidad, este protocolo se erige como el único método para mantener la viabilidad del corte durante períodos prolongados, sin embargo, los esfuerzos futuros deben evaluar los cambios funcionales a lo largo de diversos tiempos de cultivo y establecer comparaciones con islotes aislados, del mismo donante.

El paso más crítico en el proceso es la preparación cuidadosa del tejido antes de incrustarlo en agarosa. Los conductos grandes y el tejido fibrótico pueden complicar el proceso de corte y potencialmente provocar la ruptura de bloques de tejido de la agarosa. Si esto ocurre y las piezas permanecen de un tamaño razonable, se pueden reprocesar e incrustar para cortarlas. El mantenimiento de una buena calidad del tejido y un procesamiento cuidadoso mejoran en gran medida la eficiencia del procedimiento de corte y producen la máxima cantidad y calidad de cortes. El tiempo transcurrido desde la preparación del tejido hasta la generación del corte no debe exceder las 2-3 h, ya que los intervalos más largos afectan significativamente la viabilidad del tejido.

Durante la perifusión de la rebanada, un paso simple pero crítico es el recorte preciso de la rebanada para garantizar un ajuste perfecto en la cámara. Esto permite el baño adecuado del tejido y un flujo ininterrumpido. Una vez iniciado el protocolo, es fundamental evitar una mayor manipulación de las cámaras para evitar picos no deseados en la liberación de hormonas. Se debe preparar suficiente tampón y los tubos deben llegar al fondo de la solución para evitar la succión de aire y que las cámaras se sequen.

Para las imágenes de calcio es importante elegir cuidadosamente el área de interés, dependiendo de las necesidades experimentales y el diseño. Es importante minimizar el fotoblanqueo eligiendo parámetros de imagen que reduzcan la exposición a la luz o acorten el tiempo total del protocolo. Al igual que la secreción dinámica de hormonas, es crucial mantener un flujo de solución adecuado y un ajuste calentado, ya que los cortes requieren condiciones casi fisiológicas para un funcionamiento óptimo (por ejemplo, 37 ° C).

Los cortes de tejido pancreático mantienen eficazmente la integridad estructural del páncreas, preservando las conexiones célula-célula entre sus diversos tipos de células. En consecuencia, proporcionan una alternativa al trabajo con islotes aislados, facilitando la exploración simultánea de las funciones endocrinas y exocrinas y su interacción. Para evaluar la interacción de los tipos de células individuales, es crucial discriminar entre ellos. La tinción posterior es una opción, pero tiene limitaciones en términos de sondas fluorescentes disponibles y el desafío de localizar capas celulares exactas. Por lo tanto, es aconsejable incorporar estímulos específicos de la célula en el protocolo para permitir la discriminación celular basada en las respuestas. Para discriminar entre tipos de células en cortes de ratón o humanos, los estímulos efectivos incluyen adrenalina para las células alfa21,30, grelina para las células delta31, ceruleína para las células acinares 5,32, ácidos biliares para las células ductales33 y norepinefrina para las células vasculares22. Se pueden emplear estímulos similares para medir las respuestas secretoras. Mientras que los estudios de imagen se centran en células individuales, los estudios de secreción analizan la respuesta colectiva. Por lo tanto, es crucial incluir un amplio número de rebanadas para detectar los resultados deseados. La cantidad óptima puede variar entre los tipos de células, siendo suficientes tres rodajas para las células endocrinas; Sin embargo, es aconsejable utilizar más segmentos para garantizar la detectabilidad en lugar de correr el riesgo de perder información valiosa.

Al igual que cualquier otro método, los cortes de tejido tienen limitaciones que deben tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados. La aplicación de estímulos dirigidos a tipos específicos de células puede provocar efectos en otros tipos de células de la rebanada, lo que podría desencadenar bucles de retroalimentación. Sin embargo, también es importante estudiarlas y, por lo tanto, las respuestas medidas pueden ser más representativas de una respuesta fisiológica. Para la focalización selectiva de células, se pueden utilizar protocolos tradicionales in vitro . Es importante destacar que las células acinares contienen enzimas pancreáticas que pueden descomponer las proteínas y digerir el corte de tejido, lo que resulta en la degradación celular en cuestión de horas. Para mantener la viabilidad, el uso constante de inhibidores de tripsina es esencial cuando los cortes se encuentran en un estado estático, aunque su aplicación pueda interferir con la transferencia exitosa de los virus empleados para fines de etiquetado.

En comparación con el aislamiento de islotes, la variabilidad del donante y la calidad del tejido pueden afectar tanto a la cantidad como a la viabilidad de los cortes obtenidos. Una viabilidad insuficiente después del corte puede resultar en una vida útil corta y dificultar la capacidad de cultivar las rebanadas. Además, los recuentos de islotes pueden variar significativamente entre los donantes, lo que dificulta la estimación del contenido de islotes antes de realizar experimentos. En consecuencia, la selección cuidadosa de los criterios de aceptación del donante y la implementación de métodos de normalización adecuados, como el porcentaje de contenido hormonal para la secreción o el cambio de pliegue con respecto a la línea de base, son cruciales. Para obtener resultados consistentes, se recomienda evaluar la viabilidad del corte de tejido antes del experimento. Además, se recomienda incorporar estímulos de control relevantes (por ejemplo, KCl) en el experimento. En los casos de análisis de células individuales, como la obtención de imágenes, se puede implementar la preclasificación de células en función de su respuesta a estos estímulos de control. A pesar de los desafíos mencionados, los cortes ofrecen un valioso aumento a los métodos de investigación actuales.

El protocolo descrito se puede utilizar como punto de partida para varias aplicaciones, y se pueden manipular cortes de páncreas y examinar las respuestas después de una variedad de estímulos. También dirigimos a los lectores a numerosos estudios de investigación que utilizan rodajas de páncreas humano o de ratón, lo que proporciona información valiosa para quienes planean sus experimentos. En el futuro, es posible que se investiguen posibles terapias utilizando cortes de páncreas o que se modelen los mecanismos de la enfermedad.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación se realizó con el apoyo de la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), un proyecto colaborativo de investigación sobre la diabetes tipo 1 respaldado por la JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) y The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). El contenido y las opiniones expresadas son responsabilidad de los autores y no reflejan necesariamente la opinión oficial de nPOD. Las Organizaciones de Procuración de Órganos (OPO, por sus siglas en inglés) que se asocian con nPOD para proporcionar recursos de investigación se enumeran en http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Los autores agradecen a los donantes y a sus familias por su inestimable contribución. Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana de Diabetes 4-22-PDFPM (J.K.P.) y el Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (subvención 2015-PG-T1D-052).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alanine Sigma A7627 amino acid
AlexaFluor 488 goat anti-guineapig Invitrogen A11073 secondary antibody
AlexaFluor 546 goat anti-rat Thermo Fisher A11077 secondary antibody
AlexaFluor 647 goat anti-mouse Thermo Fisher A21235 secondary antibody
Aprotinin Sigma A1153 inhibitor
Arginine Sigma A5006 amino acid
Calbryte 520 AM AAT Bioquest 20651 Calcium dye
Fluo4-AM Invitrogen F14201 Calcium dye
Fluorescein diacetat Sigma F7378 viability marker
Glucagon Sigma G2654 primary antibody
Glucagon ELISA (human kit) Mercodia 10-1271-01 ELISA for hormone detection
Glutamine Sigma G3126 amino acid
Insulin Dako A-0546 primary antibody
Insulin ELISA (human) Mercodia 10-1113-01 ELISA for hormone detection
Low melting point agarose Sigma A9414
LSM 900 Zeiss confocal microscope
Pancreas Slice Chamber Biorep Technologies PERI-PSC-001 slice chamber for perifucion
Pancreas Slice Chamber Extender Kit Biorep Technologies PERI-PSC-EXT slice chamber for perifucion
Pancreas Slice Chamber Perforated Plate Biorep Technologies PERI-PSC-PP slice chamber for perifucion
Perifusion system with automated tray handling Biorep Technologies PERI4-02-230-FA
Propidium iodide Life technologies P1304MP dead marker
Semi-automatic vibratome VT1200S Leica 14048142066
Somatostatin Millipore MAB354 primary antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abdelli, S., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
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Generación de cortes de tejido pancreático humano para estudiar la fisiología endocrina y exocrina del páncreas
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Panzer, J. K., Garcia, P. A.,… More

Panzer, J. K., Garcia, P. A., Pugliese, A. Generating Human Pancreatic Tissue Slices to Study Endocrine and Exocrine Pancreas Physiology. J. Vis. Exp. (205), e66468, doi:10.3791/66468 (2024).

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