Summary
Bu protokol, fare ortotopik karaciğer transplantasyonunda manşet tekniği kullanılarak damar rekonstrüksiyonu için teknik bilgi sağlar.
Abstract
Fare ortotopik karaciğer transplantasyonu, karaciğer iskemisi ve reperfüzyon hasarının altında yatan mekanizmaları araştırmak için etkili bir metodolojidir. Bununla birlikte, teknik zorluklar, bu değerli deneysel modelin kullanılmasının ve bu becerilerin gelecek nesillere aktarılmasının önünde bir engel teşkil etmektedir. Bu prosedürün en zorlu yönü, portal ven (PV), infrahepatik inferior vena kava (IHIVC) ve suprahepatik inferior vena kava dahil olmak üzere vasküler rekonstrüksiyondur. Sütürler yerine plastik manşetlerin kullanılması, daha düzgün PV ve IHIVC rekonstrüksiyonuna izin verir. Greft damarının ucuna intravenöz bir kateterden yapılmış bir manşet takılarak ve manşetin alıcı damara yerleştirilmesiyle damarlar yeniden yapılandırılır. En önemli iki husus, geminin iç lümenini düzgün bir şekilde görselleştirmek ve aşırı güç kullanımından kaçınmaktır. Amacımız, alıcı cerrahisinde manşet tekniği kullanılarak yapılan vasküler rekonstrüksiyonlara teknik bir bakış sağlamaktır. Manşet tekniği için bu teknik ipuçlarının, mikro cerrahların vasküler rekonstrüksiyonu kolaylaştırmasına ve araştırmalarını ilerletmesine yardımcı olması bekleniyor.
Introduction
Fare ortotopik karaciğer nakli (MOLT) ilk olarak 1991 yılında bildirilen etkili bir deneysel yöntemdir1. Genetik olarak modifiye edilmiş fareler ve çeşitli araştırma reaktifleri kullanan bu deneysel model, sıcak ve soğuk iskemi ve reperfüzyon yaralanmalarının araştırılmasında çok önemli bir rol oynamıştır. Bununla birlikte, modelin yüksek teknik karmaşıklığı, karaciğer nakli için temel tıbbın geliştirilmesini engellemiştir2. MOLT üç ana adımı içerir: (1) karaciğerin donör fareden alınması, (2) arka masa cerrahisi ve (3) karaciğerin alıcıya implantasyonu. Bu alıcı prosedürler arasında vasküler anastomoz en büyük zorluğu oluşturmaktadır. Suprahepatik inferior vena kava anastomozu tipik olarak elle dikilerektamamlanırken, infrahepatik inferior vena kava (IHIVC) ve portal ven (PV) elle dikilen dikişler yerine plastik manşetler kullanılarak daha verimli bir şekilde yeniden yapılandırılabilir.
Anhepatik dönem, alıcının doğal karaciğerinin çıkarılması ile greft implantasyonu arasındaki süreyi ifade eder. Tutarlı sonuçlar elde etmek için, anhepatik süreyi 20 dakikadan daha az bir süre ile sınırlamak zorunludur. Sonuç olarak, bu modeli kullanan çalışmalar belirli kurumlarla sınırlandırılmıştır 3,4,5,6,7,8,9. MOLT'un çeşitli aşamaları arasında, anhepatik zamanı en aza indirmek ve başarılı bir transplantasyon sağlamak için düzgün PV ve IHIVC rekonstrüksiyonu elde etmek çok önemlidir.
PV ve IVC rekonstrüksiyonu genellikle vasküler manşetler kullanılarak gerçekleştirilir, çünkü manşet tekniği elle dikilen sütürlere kıyasla vasküler anastomozu basitleştirir 2,5,8. Vasküler manşetin hazırlanması ve manşetin güvenli bir şekilde takılmasında yer alan teknik, alıcı vasküler rekonstrüksiyonun karmaşıklığını önemli ölçüde etkiler. Amacımız, manşet yöntemiyle ilgili çok sayıda teknik ipucu için ayrıntılı görsel rehberlik sağlamak ve böylece öğrenme eğrisini azaltmaktır. Bu video klipler, alıcı cerrahisi sırasında manşetin damarlara nasıl takılacağının ve PV ve IHIVC'nin nasıl yeniden yapılandırılacağının net bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deney protokolü, Kyoto Üniversitesi Hayvan Deneyleri Komitesi tarafından onaylandı. Çalışmada, ticari bir kaynaktan elde edilen, 10 haftadan büyük ve 25 g ile 30 g arasında ağırlığa sahip C57BL / 6 fareleri kullanıldı (bkz. Tüm hayvanlar% 2.5 izofluran ile uyuşturuldu (kurumsal olarak onaylanmış protokoller izlenerek), belirli patojen içermeyen koşullar altında tutuldu ve tüm deneysel prosedürler Kyoto Üniversitesi'nin Hayvan Deneyleri Yönetmeliğine uygun olarak yürütüldü. Çalışma için kullanılan uygun araçlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir ve Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir.
1. Hayvan seçimi
- Vücut ağırlığı 25-30 g olan fareler kullanın.
NOT: Fare karaciğer allogreftleri2 genellikle majör histouyumluluk kompleksi bariyeri boyunca kabul edilirken, bu çalışmada soğuk iskemi reperfüzyon hasarının ayrıntılı mekanizmasına odaklanmak için sinjeneik MOLT modelini seçtik10. 25 g'dan daha hafif fareler önerilmez, çünkü ince bir safra kanalına iç stent yerleştirmek imkansızdır. Benzer şekilde, damarların etrafında çok miktarda karın içi yağ bulunması nedeniyle 30 g'dan daha ağır fareler önerilmez.
2. Manşet yapımı
- PV ve IHIVC için sırasıyla 20 G ve 16 G intravenöz kateterler hazırlayın.
- Bir neşter kullanarak, manşeti oluşturmak için kateteri kesin. Manşetin ana gövdesi 2 mm uzunluğunda ve 1 mm'lik bir uzatma kolu ile ölçülmelidir (Şekil 3A).
NOT: Sap çok büyükse, manşeti takmak zor olabilir. - Manşetin yüzeyinde, neşter bıçağının arkasını kullanarak iplik sabitlemesi için sığ bir oluk oluşturun.
NOT: Neşter bıçağının arkasını manşete uygularken, bıçağın ucunun yaklaşık 60 derecelik bir açıda olduğundan emin olun ( Şekil 3B'de gösterildiği gibi). İlk oluğu yaptıktan sonra neşter bıçağını sabitleyin ve manşeti döndürün. İdeal olarak, iki oluk önerilir, ancak tek bir oluk sorunsuz bir şekilde yeterli olabilir.
3. Manşet eki
- Dikdörtgen şekilli plastik bir kaba küçük buz küpleri koyun ve üstüne küçük bir metal kap (6 cm çapında) yerleştirin. Kabı organ koruma sıvısı ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve sinjeneik grefti içine yerleştirin.
- Sinjeneik karaciğer greftini (başka bir donör fareden ekstrakte edilen) bir pamuklu çubuk kullanarak nazikçe yuvarlayın ve porta hepatisin yukarı baktığından emin olun. IVC'nin lümeninde depolanan kanı organ koruma sıvısı ile iyice çıkarın.
- PV'yi, örneğin splenik damara bağlı bir iplik kullanarak manşetten geçirin (bkz. Şekil 4A).
- Manşet sapı saat 12 konumundayken, hem tutamağı hem de manşeti bir bulldog kelepçesi ile sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve PV kenarından 2 ila 3 mm uzağa yerleştirin.
- Ameliyat alanını oluşturmak için büyük vasküler forseps ve bir sabitleme kalıbı kullanarak bulldog kelepçesini daha da sabitleyin (bkz. Şekil 4B).
- PV lümenini yaklaşık 15 ila 20x büyütmede dikkatlice inceleyin. Gerekirse, damlayan su lümenin görünürlüğünü artırabilir.
- PV lümenini nazikçe kavrayın ve manşetten dışsallaştırın.
- Tamamen dışsallaştırıldıktan sonra, 8-0 kullanarak çift ligasyon ile sabitleyin manşetin oluğu boyunca ipek iplik (Şekil 4C,D).
NOT: Bağın gevşek olmadığından emin olun. Ayrıca, manşetin takılmasını engelleyebileceğinden, bağ noktasının çok büyük olmamasına dikkat edin. Ligatür noktası herhangi bir yönde konumlandırılabilir. - PV için kullanılana benzer bir prosedür kullanarak manşeti IHIVC'ye takın (Şekil 4E).
NOT: IHIVC'yi manşetle sıkıştırırken, karaciğer parankimini ısırmaktan kaçının. Boyun PV'den daha kısa olduğundan, sıkıştırma konumunu dikkatlice belirleyin. - IHIVC'yi geçici olarak bağlamak için ipliği IHIVC'nin tabanının etrafından geçirerek bir kayma düğümü oluşturun (Şekil 5). Bu iplik reperfüzyondan sonra çıkarılacaktır.
4. Portal ven rekonstrüksiyonu
- % 2.5 oranında izofluran ile anestezi indükleyerek alıcı fareyi uyuşturun ve yayınlanmış literatürde açıklandığı gibi doğal karaciğeri çıkarmadan önce% 0.6'ya düşürün2. Laparotomiden önce cerrahi alanı alternatif iyonofor ve% 70 etanol turları ile en az üç kez enfekte edin.
- Hepatik lobun düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden ve manşetli PV'nin bükülme ve burulma içermediğinden emin olun.
- Pean forseps kullanarak alıcının PV kenarını nazikçe kavrayın ve bir mengene ile sabitleyin.
NOT: Bu yazıda mengene, Pean forsepslerini masaya sabitlemek için kullanılan mekanik bir aparatı ifade eder. Mengene hakkında daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın. - Alıcının PV'sine vasküler bir kelepçe uygulayın ve 8-0'ı geçin etrafına ipek iplik.
- PV kenarından yaklaşık 0,5 mm uzakta 1/4 çevresel bölüm oluşturun (Şekil 6A). Özel bir alet (ucu kesilmiş ve L şeklinde bükülmüş 27 G'lik bir iğne) kullanarak tuzlu su solüsyonunu lümenden geçirirken deliği genişletin.
- Manşet kolunu kavramak için düz forseps kullanın ve lümene yerleştirin.
- Tamamen takıldıktan sonra, manşeti 8-0 ipek iplik. Fiksasyon için tek bir ligasyon yeterlidir.
- Vasküler kelepçeyi çıkarın ve karaciğeri yeniden perfüze edin.
- Bezelye forsepslerini dikkatlice serbest bırakın ve portal ven rekonstrüksiyonunu tamamlayın. Tüm PV rekonstrüksiyon süreci yaklaşık 5 dakika sürmelidir.
5. İnfrahepatik inferior vena kava rekonstrüksiyonu
- Karaciğer lobunu uygun şekilde konumlandırın ve alıcı IHIVC dorsaline bağlı Pean forsepslerini greftin sağ alt lobuna hareket ettirin ve bir mengene ile sabitleyin.
- Bir pamuklu çubukla hafifçe ovalayarak alıcının IVIHC'si çevresinde kalan karaciğer dokusunu ortadan kaldırın.
- 8-0'ı geç alıcının IVIHC'sinin etrafına ipek iplik.
- Alıcının IVIHC kenarından yaklaşık 0,5 mm'de 1/4 çevresel bölüm oluşturun (Şekil 6B).
- Lümene normal salin solüsyonu verdikten sonra, manşeti lümene yerleştirin.
NOT: Kısa boyun nedeniyle, manşet genellikle PV'dekinden daha sığ bir şekilde yerleştirilir. - Manşeti dikkatlice 8-0 ile sabitleyin ipek iplik ve ardından vasküler kelepçeyi ve Pean forsepslerini çıkarın.
6. Ameliyat sonrası bakım
- Ameliyat sonrası iyileşmeyi kolaylaştırmak için bir ısıtma yastığı ve ısıtma lambası kullanın.
- Kan basıncını, kalp atış hızını, solunum hızını, vücut ısısını ve ayrıca yiyecek ve su tüketimini sürekli olarak izleyin.
- Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için deri altı carprofen enjeksiyonu (her 6 saatte bir veya ihtiyaç duyulana kadar 5 mg / kg) uygulayın. Yerel kurumsal yönergeleri izleyin.
NOT: Farelerin durumu kötüleşirse, deney derhal durdurulacak ve farelere karbondioksit solunarak ötenazi uygulanacaktır. - Doku örneğini toplamak için fareleri yeniden uyuşturun ve IACUC onaylı bir yöntemle ötenazi yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PV rekonstrüksiyonu, portal venin klempini açtıktan sonra kıvrımlılık olmadığında ve karaciğer düzgün bir şekilde perfüze edildiğinde başarılıdır. Anhepatik süre 20 dakikanın altında olmalıdır, çünkü 25 dakikayı aşan anhepatik zamanlar fare ölüm riskini artırır. Greftten kan yetersizliği yoksa IHIVC rekonstrüksiyonu başarılı kabul edilir.
Greftin organ koruma solüsyonu kullanılarak 1 saat soğuk sıcaklıklarda saklanması, reperfüzyondan 6 saat sonra yaklaşık 2.000 U/L'lik bir serum alanin aminotransferaz seviyesi ile sonuçlanır (Şekil 7A). Transplantasyondan 7 gün sonra sağkalım oranı %100'dür (Şekil 7B). Bununla birlikte, hepatik arter anastomozu olmayan modelimizde, alıcı fareler transplantasyondan yaklaşık 30 gün sonra intrahepatik biloma ile ilgili sorunlara yenik düşebilir
Şekil 1: Vasküler rekonstrüksiyon aletleri. Durum ve ameliyat alanı için gerektiği gibi düz veya kavisli forseps kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroskop. Mikroskop, 10x büyütmeli bir objektif lens ve en az 0.8x büyütmeli bir mercek merceği ile donatılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Manşetin hazırlanması. (A) PV ve IHIVC için manşet. (B) Manşet üzerinde bir oluk oluşturma işleminin şematik bir temsili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Manşet eki. (A) PV'ye bağlı iplik manşete geçirilir. (B) Manşet bağlantısı için cihaz kurulumu. (C) Manşeti 8-0 ile sabitlemek ipek ligasyonları. (D) Vasküler eksternalizasyonun ve manşete fiksasyonun şematik gösterimi. (E) Tamamlanmış manşet eki. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: IHIVC kökünün geçici ligasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Vasküler rekonstrüksiyon. Bu resim, (A) PV ve (B) IHIVC için delik oluşturma yerlerini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Ameliyat sonrası sonuçlar. (A) Reperfüzyondan 6 saat sonra serum alanin aminotransferaz (ALT) seviyeleri. CIT, soğuk iskemik zaman; Tx, transplantasyon. p < 0.0001. (B) MOLT'tan sonra alıcının hayatta kalması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vasküler rekonstrüksiyonu öğrenmek, başarılı MOLT'a ulaşmanın en zorlu yönüdür. Manşetin kalitesi, farelerin küçük boyutu göz önüne alındığında, rekonstrüksiyonun zorluğunu önemli ölçüde etkiler5. Bu makale, manşet hazırlığı, takılması ve rekonstrüksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlar.
Manşet hazırlığı ve bağlantı 2,5 ile ilgili önceki raporlardan büyük farklılıklar olmasa da, bazı küçük noktalar dikkate alınmalıdır. İlk olarak, manşet sapının kalınlığı toplam çevrenin yaklaşık 1 / 6'sı ile sınırlandırılmalıdır. Çok inceyse, sap kolayca bükülebilir ve kavranması zorlaşabilir. Çok kalınsa, alıcının karnında ele alınması zor olabilir. Kişisel tercihinizi erkenden belirlemek çok önemlidir.
İkincisi, arka tabladaki lümenin görünürlüğü çok önemlidir. PV lümenini doğrulamak için donörün dalak damarına bir dönüm noktası olarak tutturulmuş bir 10-0 naylon iplik kullanılır. Naylon iplik, aşırı bükülmeyi önlemek için saat 8 konumuna yerleştirilmiştir. Damar duvarı, saat 3 ve saat 9 pozisyonlarında iki forseps ile kavranarak ve saat 6 pozisyonunda manşet duvarına bastırılarak dışsallaştırılır. 8-0 ile fiksasyon İpek ipliği dikkatli hareketler gerektirir. Oluğa sabitlenerek yeterli sabitleme sağlanır. Taktıktan sonra, çıkmadığını doğrulamak için manşeti kaldırın.
Üçüncüsü, rekonstrüksiyon sırasında, alıcı damarda çok büyük bir delik oluşturmamak önemlidir, çünkü manşet yerleştirildikçe delik doğal olarak genişler. Büyük bir delik açmak, arızanın en yaygın nedeni olan damar bölünmesine yol açabilir. Özellikle IHIVC rekonstrüksiyonunda, IHIVC'nin daha kısa uzunluğu, bir PV'den daha kolay çekilmesini sağladığından daha küçük delikler açılmalıdır. Salin solüsyonunu lümenden geçirirken, aşağı doğru değil yukarı doğru kuvvet uygulayarak manşet yerleştirmeyi destekleyin.
Yaygın başarısızlık nedenleri ve önlemler ayrıntılı olarak tartışılmıştır. En önemli noktalar, iç damar lümeninin net bir şekilde görüntülenmesini sağlamak ve damar ayrılmasını önlemek için manşet yerleştirme sırasında gereksiz kuvvetten kaçınmayı içerir. Manşet yöntemi için bu teknik ipuçlarının becerileri artırdığına ve araştırmayı ilerlettiğine inanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir yazarın açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, 2022 JST temel araştırması (Japon Organ Nakli Derneği) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
