Summary
Dieses Protokoll enthält technische Informationen für die Gefäßrekonstruktion mit der Manschettentechnik bei der orthotopen Lebertransplantation der Maus.
Abstract
Die orthotope Lebertransplantation der Maus ist eine effektive Methode zur Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen von Leberischämie und Reperfusionsschäden. Die technischen Herausforderungen stellen jedoch ein Hindernis dar, um dieses wertvolle experimentelle Modell zu nutzen und diese Fähigkeiten an die nächste Generation weiterzugeben. Der schwierigste Aspekt dieses Eingriffs ist die Gefäßrekonstruktion, einschließlich der Pfortader (PV), der infrahepatischen unteren Hohlvene (IHIVC) und der suprahepatischen unteren Hohlvene. Die Verwendung von Kunststoffmanschetten anstelle von Nähten ermöglicht eine reibungslosere PV- und IHIVC-Rekonstruktion. Bei der Rekonstruktion der Gefäße wird eine Manschette aus einem intravenösen Katheter an der Spitze des Transplantatgefäßes befestigt und die Manschette in das Empfängergefäß eingesetzt. Die beiden wichtigsten Aspekte sind die richtige Visualisierung des inneren Lumens des Gefäßes und die Vermeidung übermäßiger Krafteinwirkung. Unser Ziel ist es, einen technischen Überblick über Gefäßrekonstruktionen mit der Manschettentechnik in der Empfängerchirurgie zu geben. Diese technischen Tipps für die Manschettentechnik sollen Mikrochirurgen dabei helfen, die Gefäßrekonstruktion zu erleichtern und ihre Forschung voranzutreiben.
Introduction
Die orthotope Lebertransplantation (MOLT) der Maus ist eine wirksame experimentelle Methode, über die erstmals 1991 berichtetwurde 1. Dieses experimentelle Modell, das genetisch veränderte Mäuse und verschiedene Forschungsreagenzien verwendet, hat eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung von warmer und kalter Ischämie und Reperfusionsverletzungen gespielt. Die hohe technische Komplexität des Modells hat jedoch die Entwicklung einer Basismedizin für die Lebertransplantation behindert2. Die MOLT umfasst drei Hauptschritte: (1) die Entnahme der Leber aus der Spendermaus, (2) die Operation am Rückentisch und (3) die Implantation der Leber in den Empfänger. Unter diesen Empfängerverfahren stellt die vaskuläre Anastomose die größte Herausforderung dar. Während die suprahepatische Anastomose der unteren Hohlvene typischerweise durch eine Handnahtvervollständigt wird 2, können die infrahepatische untere Hohlvene (IHIVC) und die Pfortader (PV) mit Kunststoffmanschetten anstelle von handgenähten Nähten effizienter rekonstruiert werden.
Die anhepatische Periode bezeichnet das Intervall zwischen der Entnahme der nativen Leber des Empfängers und der Implantation des Transplantats. Um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten, ist es zwingend erforderlich, die anhepatische Zeit auf weniger als 20 Minuten zu begrenzen. Folglich wurden Studien, die dieses Modell anwendeten, aufbestimmte Institutionen beschränkt 3,4,5,6,7,8,9. Unter den verschiedenen Stadien der MOLT ist eine reibungslose PV- und IHIVC-Rekonstruktion entscheidend, um die anhepatische Zeit zu minimieren und eine erfolgreiche Transplantation zu gewährleisten.
Die PV- und IVC-Rekonstruktion wird in der Regel mit Hilfe von Gefäßmanschetten durchgeführt, da die Manschettentechnik die Gefäßanastomose im Vergleich zu handgenähten Nähten vereinfacht 2,5,8. Die Technik, die mit der Vorbereitung der Gefäßmanschette und der sicheren Befestigung der Manschette verbunden ist, hat einen erheblichen Einfluss auf die Komplexität der Gefäßrekonstruktion des Empfängers. Unser Ziel ist es, eine detaillierte visuelle Anleitung für zahlreiche technische Tipps im Zusammenhang mit der Manschettenmethode zu geben und so die Lernkurve zu verkürzen. Diese Videoclips vermitteln ein klares Verständnis dafür, wie die Manschette an den Gefäßen befestigt und die PV und IHIVC während der Empfängeroperation rekonstruiert werden.
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Protocol
Das Versuchsprotokoll wurde vom Tierversuchsausschuss der Universität Kyoto genehmigt. In der Studie wurden C57BL/6-Mäuse verwendet, die über 10 Wochen alt waren und zwischen 25 g und 30 g wogen, die aus einer kommerziellen Quelle gewonnen wurden (siehe Materialtabelle). Alle Tiere wurden mit 2,5 % Isofluran betäubt (nach institutionell anerkannten Protokollen), unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten, und alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Tierversuchsvorschriften der Universität Kyoto durchgeführt. Die für die Studie verwendeten Instrumente sind in der Materialtabelle aufgeführt und in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt.
1. Auswahl der Tiere
- Verwenden Sie Mäuse mit einem Körpergewicht von 25-30 g.
HINWEIS: Während Mausleber-Allotransplantate2 im Allgemeinen über die Haupthistokompatibilitätskomplexbarriere hinweg akzeptiert werden, haben wir uns in dieser Studie für das syngene MOLT-Modell entschieden, um uns auf den detaillierten Mechanismus der Reperfusionsschädigung durch Kälteischämiezu konzentrieren 10. Mäuse mit einem Gewicht von weniger als 25 g werden nicht empfohlen, da es unmöglich ist, einen inneren Stent in einen dünnen Gallengang einzuführen. Ebenso werden Mäuse mit einem Gewicht von mehr als 30 g nicht empfohlen, da eine große Menge an intraabdominalem Fett um die Gefäße herum vorhanden ist.
2. Herstellung von Manschetten
- Bereiten Sie 20 g bzw. 16 g intravenöse Katheter für die PV bzw. IHIVC vor.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell den Katheter ab, um die Manschette zu erstellen. Der Hauptkörper der Manschette sollte 2 mm lang sein und einen Verlängerungsgriff von 1 mm haben (Abbildung 3A).
HINWEIS: Wenn der Griff zu groß ist, kann es schwierig werden, die Manschette einzuführen. - Gestalte auf der Oberfläche der Manschette eine flache Rille für die Fadenfixierung mit dem Rücken der Skalpellklinge.
HINWEIS: Wenn Sie den Rücken der Skalpellklinge auf die Manschette aufsetzen, stellen Sie sicher, dass die Spitze der Klinge in einem Winkel von ca. 60 Grad steht (wie in Abbildung 3B gezeigt). Nachdem Sie die erste Rille gemacht haben, befestigen Sie die Skalpellklinge und drehen Sie die Manschette. Im Idealfall werden zwei Rillen empfohlen, aber eine einzige Rille kann ohne Probleme ausreichen.
3. Manschetten-Befestigung
- In einen rechteckigen Kunststoffbehälter kleine Eiswürfel geben und einen kleinen Metallbecher (6 cm Durchmesser) darauf stellen. Füllen Sie den Becher mit Organkonservierungsflüssigkeit (siehe Materialtabelle) und legen Sie das syngene Transplantat hinein.
- Rollen Sie das syngene Lebertransplantat (das von einer anderen Spendermaus gewonnen wurde) vorsichtig mit einem Wattestäbchen und achten Sie darauf, dass die Porta hepatis nach oben zeigt. Entfernen Sie gründlich jegliches Blut, das im Lumen der IVC gespeichert ist, mit Organerhaltungsflüssigkeit.
- Fädeln Sie das PV mit einem Faden, der z. B. an der Milzvene befestigt ist, durch die Manschette (siehe Abbildung 4A).
- Wenn sich der Manschettengriff in der 12-Uhr-Position befindet, befestigen Sie sowohl den Griff als auch die Manschette mit einer Bulldog-Klemme (siehe Materialtabelle) und positionieren Sie sie 2 bis 3 mm von der PV-Kante entfernt.
- Befestigen Sie die Bulldog-Klemme weiter mit einer großen Gefäßzange und einer Fixierform, um das Operationsfeld zu etablieren (siehe Abbildung 4B).
- Überprüfen Sie das PV-Lumen sorgfältig bei ca. 15- bis 20-facher Vergrößerung. Falls erforderlich, kann Tropfwasser die Sichtbarkeit des Lumens verbessern.
- Fassen Sie das PV-Lumen vorsichtig an und geben Sie es durch die Manschette nach außen.
- Sobald es vollständig externalisiert ist, sichern Sie es mit einer doppelten Ligatur mit 8-0 Seidenfaden entlang der Rille der Manschette (Abbildung 4C,D).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Ligatur nicht locker ist. Achten Sie auch darauf, dass der Ligaturpunkt nicht zu groß ist, da er das Einsetzen der Manschette beeinträchtigen kann. Der Ligaturpunkt kann in jede Richtung positioniert werden. - Befestigen Sie die Manschette am IHIVC mit einem ähnlichen Verfahren wie beim PV (Abbildung 4E).
HINWEIS: Wenn Sie den IHIVC mit der Manschette festklemmen, vermeiden Sie es, in das Leberparenchym zu beißen. Da der Hals kürzer als der PV ist, bestimmen Sie vorsichtig die Klemmposition. - Erstellen Sie einen Slipknot, indem Sie den Faden um die Basis des IHIVC führen, um den IHIVC vorübergehend zu ligieren (Abbildung 5). Dieser Faden wird nach der Reperfusion entfernt.
4. Rekonstruktion der Pfortader
- Anästhesie der Empfängermaus durch Induktion einer Anästhesie mit Isofluran bei 2,5 % und Reduzierung auf 0,6 %, bevor die native Leber extrahiert wird, wie in der veröffentlichten Literatur beschrieben2. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mindestens dreimal mit abwechselnden Runden Iodophor und 70%igem Ethanol vor der Laparotomie.
- Stellen Sie sicher, dass der Leberlappen richtig positioniert ist und dass der PV mit der Manschette frei von Knicken und Torsion ist.
- Fassen Sie die PV-Kante des Rezipienten vorsichtig mit einer Pean-Pinzette an und sichern Sie sie mit einem Schraubstock.
HINWEIS: In diesem Artikel bezieht sich ein Schraubstock auf eine mechanische Vorrichtung, mit der die Pean-Pinzette auf dem Tisch befestigt wird. Weitere Informationen zum Schraubstock finden Sie unter Materialtabelle. - Bringen Sie eine Gefäßklemme auf den PV des Empfängers an und übergeben Sie eine 8-0 Seidenfaden drumherum.
- Erstellen Sie einen 1/4-Umfangsquerschnitt ca. 0,5 mm von der PV-Kante entfernt (Abbildung 6A). Vergrößern Sie das Loch, während Sie die Kochsalzlösung mit einem speziellen Instrument (einer 27-G-Nadel, bei der die Spitze abgeschnitten und in eine L-Form gebogen wird) durch das Lumen leiten.
- Fassen Sie den Manschettengriff mit einer geraden Pinzette und führen Sie ihn in das Lumen ein.
- Sobald sie vollständig eingesetzt ist, sichern Sie die Manschette mit einem 8-0 Seidenfaden. Für die Fixation ist eine einzige Ligatur ausreichend.
- Entfernen Sie die Gefäßklemme und persolidieren Sie die Leber.
- Lösen Sie vorsichtig die Pean-Pinzette und schließen Sie die Rekonstruktion der Pfortader ab. Der gesamte PV-Umbau sollte ca. 5 Minuten dauern.
5. Rekonstruktion der infrahepatischen Vena cava inferior
- Positionieren Sie den Leberlappen entsprechend und bewegen Sie die Pean-Pinzette, die an der IHIVC-Empfängerzange befestigt ist, dorsal zum rechten Unterlappen des Transplantats und sichern Sie sie mit einem Schraubstock.
- Entfernen Sie restliches Lebergewebe um das IVIHC des Empfängers, indem Sie es vorsichtig mit einem Wattestäbchen abreiben.
- Pass an 8-0 Seidenfaden um den IVIHC des Empfängers.
- Erstellen Sie einen 1/4-Umfangsschnitt in einem Abstand von ca. 0,5 mm von der IVIHC-Kante des Empfängers (Abbildung 6B).
- Nachdem Sie normale Kochsalzlösung in das Lumen eingeführt haben, führen Sie die Manschette in das Lumen ein.
HINWEIS: Durch den kurzen Halsausschnitt wird die Manschette oft flacher eingesetzt als bei der PV. - Sichern Sie die Manschette vorsichtig mit einem 8-0 Seidenfaden und entfernen Sie dann die Gefäßklemme und die Pean-Pinzette.
6. Nachsorge
- Verwenden Sie ein Heizkissen und eine Wärmelampe, um die postoperative Genesung zu erleichtern.
- Überwachen Sie kontinuierlich Blutdruck, Herzfrequenz, Atemfrequenz, Körpertemperatur sowie Nahrungs- und Wasserverbrauch.
- Verabreichung von subkutaner Injektion von Carprofen (5 mg/kg, alle 6 h oder bis zur Bedarf) zur Linderung der postoperativen Schmerzen. Befolgen Sie die lokalen institutionellen Richtlinien.
HINWEIS: Wenn sich der Zustand der Mäuse verschlechtert, wird das Experiment sofort abgebrochen und die Mäuse werden durch Einatmen von Kohlendioxid eingeschläfert. - Um die Gewebeprobe zu entnehmen, betäuben Sie die Mäuse erneut und euthanasieren Sie sie mit einer von der IACUC zugelassenen Methode.
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Representative Results
Die PV-Rekonstruktion ist erfolgreich, wenn beim Lösen der Pfortader keine Tortuosität auftritt und die Leber gleichmäßig durchblutet ist. Die anhepatische Zeit sollte unter 20 Minuten liegen, da anhepatische Zeiten von mehr als 25 Minuten das Mortalitätsrisiko bei Mäusen erhöhen. Die IHIVC-Rekonstruktion gilt als erfolgreich, wenn keine Blutinsuffizienz aus dem Transplantat vorliegt.
Die Lagerung des Transplantats bei kalten Temperaturen für 1 h mit Organkonservierungslösung führt zu einem Serum-Alanin-Aminotransferase-Spiegel von etwa 2.000 U/L 6 h nach der Reperfusion (Abbildung 7A). Die Überlebensrate liegt 7 Tage nach der Transplantation bei 100 % (Abbildung 7B). In unserem Modell ohne Anastomose der Leberarterie können Empfängermäuse jedoch etwa 30 Tage nach der Transplantation intrahepatischen bilomabedingten Problemen erliegen
Abbildung 1: Instrumente für die Gefäßrekonstruktion. Je nach Situation und Operationsfeld wird eine gerade oder gebogene Pinzette verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Das Mikroskop. Das Mikroskop ist mit einer Objektivlinse mit 10-facher Vergrößerung und einer Okularlinse mit mindestens 0,8-facher Vergrößerung ausgestattet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Präparation der Manschette. (A) Die Manschette für PV und IHIVC. (B) Eine schematische Darstellung des Prozesses der Erzeugung einer Rille auf der Manschette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Befestigung der Manschette. (A) Der an der PV befestigte Faden wird in die Manschette eingeführt. (B) Instrumenteneinrichtung für die Manschettenbefestigung. (C) Sichern der Manschette mit 8-0 Seidenligationen. (D) Schematische Darstellung der vaskulären Externalisierung und Fixierung an der Manschette. (E) Abgeschlossene Manschettenbefestigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Temporäre Ligation der IHIVC-Wurzel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Gefäßrekonstruktion. Diese Abbildung zeigt die Positionen zum Erstellen von Bohrungen für (A) PV und (B) IHIVC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Postoperative Ergebnisse. (A) Serumspiegel der Alaninaminotransferase (ALT) 6 h nach der Reperfusion. CIT, kalte ischämische Zeit; Tx, Transplantation. p < 0,0001. (B) Überleben des Empfängers nach MOLT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das Erlernen der Gefäßrekonstruktion ist der schwierigste Aspekt auf dem Weg zu einem erfolgreichen MOLT. Die Qualität der Manschette hat einen erheblichen Einfluss auf die Schwierigkeit der Rekonstruktion, da die Größe der Mäusegering ist 5. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung, Befestigung und Rekonstruktion der Manschette.
Obwohl es keine großen Unterschiede zu früheren Berichten bezüglich der Manschettenpräparation und -verbindung gibt 2,5, sollten einige kleinere Punkte beachtet werden. Zunächst sollte die Dicke des Manschettengriffs auf ca. 1/6 des Gesamtumfangs begrenzt werden. Ist er zu dünn, kann sich der Griff leicht verbiegen und schwer zu greifen sein. Wenn es zu dick ist, kann es schwierig sein, es im Bauch des Empfängers zu handhaben. Es ist wichtig, Ihre persönlichen Präferenzen frühzeitig zu erkennen.
Zweitens ist die Sichtbarkeit des Lumens am hinteren Tisch entscheidend. Es wird ein 10-0 Nylonfaden verwendet, der an der Milzvene des Spenders befestigt ist, um das PV-Lumen zu bestätigen. Der Nylonfaden befindet sich bei 8 Uhr, um ein übermäßiges Verdrehen zu verhindern. Die Gefäßwand wird nach außen geführt, indem man sie bei 3 Uhr und 9 Uhr mit zwei Pinzetten greift und gegen die Manschettenwand bei 6 Uhr drückt. Fixierung mit 8-0 Seidenfaden erfordert vorsichtige Bewegungen. Eine adäquate Fixierung wird durch die Befestigung in der Nut erreicht. Heben Sie die Manschette nach dem Anbringen an, um sicherzustellen, dass sie sich nicht löst.
Drittens ist es wichtig, bei der Rekonstruktion kein zu großes Loch in das Empfängergefäß zu schaffen, da sich das Loch beim Einsetzen der Manschette auf natürliche Weise vergrößert. Das Bohren eines großen Lochs kann zum Splittern des Gefäßes führen, der häufigsten Fehlerursache. Insbesondere bei der IHIVC-Sanierung sollten kleinere Löcher gemacht werden, da es durch die kürzere Länge von IHIVC leichter herausgezogen werden kann als bei einer PV. Wenn Sie Kochsalzlösung durch das Lumen leiten, unterstützen Sie das Einsetzen der Manschette, indem Sie eine Kraft nach oben und nicht nach unten ausüben.
Häufige Fehlerursachen und Vorsichtsmaßnahmen wurden ausführlich besprochen. Zu den wichtigsten Punkten gehören die klare Darstellung des inneren Gefäßlumens und die Vermeidung unnötiger Krafteinwirkung beim Einsetzen der Manschette, um einen Gefäßriss zu verhindern. Es wird angenommen, dass diese technischen Tipps für die Manschettenmethode die Fähigkeiten verbessern und die Forschung voranbringen.
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Disclosures
Kein Autor hat Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die JST-Grundlagenforschung 2022 (The Japanese Society for Transplantation) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
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