DNA - النظائر المستقرة جس (DNA - SIP)
Summary
DNA – النظائر مستقرة تحقق هو أسلوب زراعة مستقل لتحديد وتوصيف المجتمعات النشطة من الكائنات الحية الدقيقة التي هي قادرة على الاستفادة من ركائز محددة. استيعاب الركيزة المخصب في النظائر الثقيلة يؤدي إلى دمج ذرات المسمى في الكتلة الحيوية الميكروبية. الكثافة تنبيذ فائق التدرج يسترد الحمض النووي المسمى لتحاليل جزيئية المصب.
Abstract
DNA – النظائر مستقرة تحقق (DNA – SIP) هو أسلوب قوي للتعرف على الميكروبات النشطة التي ركائز استيعاب الكربون والمواد الغذائية ولا سيما في الكتلة الخلوية. على هذا النحو ، وقد تم زراعة هذه التقنية المستقلة منهجية هامة لإسناد وظيفة التمثيل الغذائي للمجتمعات التي تسكن مجموعة متنوعة واسعة من البيئات البرية والمائية. بعد حضانة عينة بيئية مستقرة ، مع النظائر المركبات المسمى ، يخضع لاستخراج الحمض النووي تنبيذ فائق التدرج الكثافة واللاحقة تجزيء متدرجة لفصل الأحماض النووية للكثافات مختلفة. باسترداد المسمى تنقية الحمض النووي من كلوريد السيزيوم ولا تحمل علامات الحمض النووي لالتوصيف الجزيئي لاحقة (مثل بصمات الأصابع ، ميكروأرس والمكتبات استنساخ ، metagenomics). إن الرب الفيديو هذا البروتوكول يوفر البصرية خطوة بخطوة تفسيرات للبروتوكول للتجزيء الكثافة تنبيذ فائق التدرج التدرج ، والانتعاش من الحمض النووي المسمى. البروتوكول يتضمن أيضا نموذج بيانات المسبار ويسلط الضوء على النصائح الهامة ويحذر التي يجب مراعاتها لضمان نجاح المسبار الحمض النووي التحليل.
Protocol
Discussion
التصميم السليم للنظائر مستقرة ، يحقق التجارب ذات أهمية حاسمة للحصول على الحمض النووي المسمى أعلاه المجتمع الخلفية لا تحمل علامات. وقد نوقشت الاعتبارات المتصلة عينة مرات الحضانة ، وتركيزات الركيزة ، وشروط الحضانة (المواد الغذائية على سبيل المثال ، رطوبة التربة) ، عب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق المنح والمشاريع الاستراتيجية لاكتشاف JDN من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
| Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
| Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
| Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
| Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
| Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
| Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
| Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
| Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
| Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
| Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
| Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
| Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |
References
- Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
- Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).
- Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).
- Padmanabhan, P. Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).
- Bernard, L. Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques. Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).
- Haichar, e. l. Z. a. h. a. r., F, . Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing. Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).
- Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients. J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).
- Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -. F., Nelson, T. A. Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).
- Schwartz, E. Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).
- Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology. Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).
- Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays. J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).
- Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant. Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).
- Chen, Y. Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands. Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).
- Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics. Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).
- Kalyuzhnaya, M. High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities. Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2, 233-241 (2008).
- Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D., Timmis, K. N. . Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 4137-4158 (2010).
- Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age. ISME J. 1, 103-110 (2007).
- Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 .
