Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie
Summary
Dieser Artikel wird detailliert die Verfahren zur Messung der Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie.
Abstract
Calpaine sind allgegenwärtig intrazellulären Calcium-sensitiven, neutral Cystein-Proteasen<sup> 1</sup>. Calpaine spielen eine entscheidende Rolle in vielen physiologischen Prozessen, einschließlich der Signalisierung, Zytoskelett-Umbau, Regulation der Genexpression, Apoptose und Zellzyklus-Progression<sup> 1</sup>. Calpaine haben in vielen Pathologien wie Muskeldystrophien, Krebs, Diabetes, Alzheimer und Multipler Sklerose beteiligt<sup> 1</sup>. Calpain Regelung ist komplex und noch nicht vollständig geklärt. mRNA-und Proteinebene korrelieren schlecht mit der Tätigkeit, Beschränkung der Verwendung von Gen-oder Protein-Expression Techniken Calpain-Aktivität zu messen. Dieses Video-Protokoll Details ein durchflusszytometrischen Assays in unserem Labor zur Messung von Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen entwickelt. Diese Methode verwendet das fluoreszierende Substrat BOC-LM-CMAC, die speziell durch Calpain gespalten, um Calpain-Aktivität zu messen.<sup> 2</sup> In diesem Video wird Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Maus 32Dkit Leukämiezellen, allein oder als Teil eines Splenozyten Bevölkerung gemessen mit einem LSRII (BD Bioscience). 32Dkit Zellen gezeigt zu haben, erhöhte Aktivität in den normalen Splenozyten verglichen.
Protocol
Discussion
Die Calpain-Aktivität in fixierten und lebenden Zellen 32Dkit hat in diesem Video-Protokoll bestimmt. Die Behandlung der Zelllinie mit dem Calpain-Inhibitor PD150606 führte zu einer vollständigen Hemmung von Calpain-Aktivität in den Zellen. Darüber hinaus führte die Behandlung mit dem Inhibitor PD98059 MEK1 in eine vollständige Hemmung von Calpain-Aktivität in den Zellen. ERK ist ein wichtiger Aktivator von Calpain-2 3. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Calpain-2-Aktivität überwiegt in der 32Dkit Ze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt durch Zuschüsse aus dem Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society of Canada und der Lymphoma Foundation of Canada.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
References
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
