유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Summary

이 문서 유동세포계측법를 사용하여 고정하고 살아있는 세포에서 calpain 활동을 측정하기위한 세부 프로토콜을 것입니다.

Abstract

Calpains는 유비 쿼터스 세포, 칼슘 구분, 중립 시스테인 프로 테아제 아르¹. Calpains는 신호, cytoskeletal 리모델링, 유전자 발현, apoptosis의 조절 및 세포주기의 진행 등 많은 생리 과정에서 중요한 역할을¹. Calpains는 근육질 dystrophies, 암, 당뇨병, 알츠하이머 질환과 다중 경화증 등 많은 pathologies에 연루되었습니다¹. Calpain 규정은 복잡하고 불완전하게 이해된다. mRNA와 단백질 수준 calpain 활동을 측정하는 유전자 또는 단백질 표현 기법의 사용을 제한, 활동이 저조한 상관 관계. 이 비디오 프로토콜 세부 사항은 고정 및 살아있는 세포에서 calpain 활동을 측정하기위한 우리 연구실에 흐름 cytometric 분석을 개발했습니다. 이 방법은 calpain에 의해 구체적으로 죽습니다 형광 기판 BOC – LM – CMAC은, calpain 활동을 측정합니다.²이 비디오에서는 고정 생활 murine 32Dkit의 백혈병 세포, 혼자 또는 splenocyte 인구의 일부로 calpain 활동 LSRII (BD Bioscience)를 사용하여 측정됩니다. 32Dkit 전지는 고가 활동이 정상 splenocytes에 비해해야 표시됩니다.

Protocol

시약 준비 참고 : 모든 PBS는 칼슘 2 +와 MG 2가 포함되어 + 탐지 시약 방 온도를 PBS로 20μM 7 – 아미노 – 4 – chloromethyl coumarin, T – BOC – 류신 – 메티오닌 아미드를 (BOC – LM – CMAC) 추가합니다. 각각의 세포 현탁액은 2mL 탐지 시약을 필요로합니다. 1 % Paraformaldehyde (고정 세포) 방 온도를 PBS에 4 % paraformaldehyde 주식 솔루션을 희석. 각 외과 ?…

Discussion

고정 생활 32Dkit 세포의 calpain 활동이 비디오 프로토콜에서 결정되었습니다. calpain 억제제 PD150606과 세포 라인의 치료는 세포의 calpain 활동의 완전한 억제 결과. 또한, MEK1 억제제 PD98059 치료는 세포의 calpain 활동의 완전한 억제 결과. ERK는 calpain – 2 ^3의 주요 활성입니다. 이러한 결과는 calpain – 2 활동이 32Dkit 세포의 지배는 것이 좋습니다. 우리 연구실에서 현재 작업 증가 calpain 활동의 결과와…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde		Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606		Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059		Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes		Invitrogen
LSR II		BD Bioscience		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.