ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）
Summary
このプロトコルは、クロマチン免疫沈降（ChIP）はシグナル伝達経路によって誘導される転写を調節するクロマチンテンプレートに動的な変化を研究するために使用される方法について説明します。
Abstract
細胞外リガンドの種類に応じで、STAT（転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）の転写因子は、急速にそれらが単一のチロシン残基1のリン酸化によって活性化される細胞表面の受容体の細胞質に彼らの潜在的な状態から採用されています。そして、彼らは二量体化と成長、分化、恒常性と免疫応答に影響を及ぼす、標的遺伝子の転写を駆動するために核内に移行。当然のことながら、正常な細胞プロセスにおけるそれらの広範な関与を考えると、STATの機能の調節不全は、特に癌2および自己免疫疾患3に、人間の病気に貢献しています。
それはよく転写が4,5クロマチン鋳型への変化によって調節されることを確立されている。これらの変化はATP依存性複合体だけでなく、共有結合性のヒストン修飾とDNAメチル化6の活動が含まれています。遺伝子発現のSTATの活性化が急速かつ一過性でもあるので、STAT依存性遺伝子座における変調クロマチンテンプレートの特定のメカニズムが必要です。これらのメカニズムを定義するには、我々は、ヒストン修飾とSTATシグナルに応答する遺伝子座でそれらを生成する酵素活性を特徴づける。このプロトコルは、クロマチン免疫沈降、STATが活性化する遺伝子の発現にクロマチンにシグナル伝達の研究のための貴重な方法を説明します。
Protocol
Discussion
概説ChIPのプロトコールは、20を超える異なるヒストン修飾アッセイするために、ラボで正常に使用されています。さらに、我々は転写因子の占有率の変化、いくつかのIFN -γ誘導される遺伝子におけるヒストン修飾酵素、ヒストン修飾やRNAポリメラーゼIIの転写機構を認識するタンパク質を、特徴付けている。我々はまた、癌幹細胞10の分化中にヒストン修飾の変化を特徴づけるための…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、バージニア大学、バージニア大学がんセンターとトーマスF.とケイトミラーJeffressメモリアルトラストによってサポートされています。我々は、細胞株についてはジェームズE.ダーネルラボ（ロックフェラー大学）ロバートロスラボ（フォーダム大学）に感謝します。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | ||
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros | AC32715-5000 | ||
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche | 1836153 | ||
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | ||
| DMEM | Hyclone | SH30243 | ||
| DTT | Sigma | D0632 | ||
| EDTA | Fisher | BP118-500 | ||
| Ethanol | Pharmco | zp1110EP | ||
| Glycine | Roche | 100149 | ||
| Glycogen | Roche | 901393 | ||
| HEPES | Sigma | H3784 | ||
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | ||
| IgG | Jackson Immunoresearch |
109-005-003 |
||
| KCl | MP Biologicals | |||
| LiCl | Sigma | L4408 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| Sodium Acetate | Fisher | BP333-500 | ||
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher | BP349-100 | ||
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | ||
| NP40 | US Biological | N3500 | ||
| Anti-Histone H3, CT, pan | Millipore | 07-690 | ||
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher | 108-95-2 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fisher | 7647-14-5 | ||
| PMSF | EMD | 50-230-0316 | ||
| Proteinase K | 5-Prime | 2500140 | ||
| RNAse A | 5-Prime | 2500130 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | Millipore | 16-157 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | Millipore | 16-201 | ||
| SDS | Fisher | BP166-500 | ||
| Tris-Cl | Sigma | T5941 | ||
| Triton X-100 | Acros | 327372500 | ||
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | ||
| Anti-STAT1 | Santa Cruz | sc-345X | ||
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz | sc-899 |
References
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