이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation (칩)가 신호 전달 경로에 의해 유도 전사 조절 염색질 템플릿 동적 변경을 연구하는 데 사용됩니다 방법을 설명합니다.
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방법 논문
인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)
이 논문에서
요약
초록
세포외 리간드의 다양한 대응, STAT (전사의 신호 변환기 및 활성)이 전사 요소 빠르게들은 하나의 티로신 잔기 1 인산화에 의해 활성화됩니다 세포 표면 수용체에 세포질에서 숨겨진 상태에서 모집하고 있습니다. 그들은 다음 성장, 분화, 항상성 및 면역 반응에 영향을 미치는 대상 유전자의 전사를 드라이브에 핵을 dimerize 및 이동시키다. 되지 놀랍게도, 정상적인 세포 프로세스에서 광범위한 참여에 따라, STAT 기능의 dysregulation 특히 암 2 면역 질환 3, 인간의 질병에 기여하고 있습니다.
그것은 잘 녹음이 4,5 염색질 템플릿 변경에 의해 규제되어 설정됩니다. 이러한 변경은 ATP에 의존 단지뿐만 아니라 공유 결합 히스톤 수정 및 DNA의 methylation 6 활동을 포함합니다. 유전자 표현의 STAT 활성화가 신속하고 과도 모두이기 때문에, 그것은 STAT - 의존 유전자 loci modulating에서 염색질 템플릿에 대한 구체적인 메커니즘이 필요합니다. 이러한 메커니즘을 정의하려면, 우리는 히스톤 수정 및 STAT 신호에 응답 유전자 loci에서 그들을 생성하는 효소 활동을 특징. 이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation, STAT가 활성 유전자 발현의 염색질에 신호의 연구에 대한 가치있는 방법을 설명합니다.
프로토콜
계획
칩 실험이 계획되어 하루 전에, 세포가 충분한 숫자가 제공되도록 교양하여야한다. 각 칩 분석이 ~ 1-1.5 X 10 7 세포가 필요합니다 있다고 가정합니다. 항상 부정적인 (IgG)와 긍정적인 (팬 히스톤 항체) 컨트롤과 중복 실험을 모두 할 계획입니다.
팁 - 2FTGH 전지, 각 칩 분석이 80 % confluency 15 약 cm 조직 문화 요리가 필요합니다.
1 부 : 염색질 준비와 칩을 수행
- 문화 미디어를 제거와 10 %의 우주 송아지 혈청 (CCS) / 5 NG / ML에서 IFN - 감마를 포함한 DMEM 20 ML로 필요한 시간에 대한 세포를 유도. CCS / DMEM뿐만 아니라 10 % 20 ML과 uninduced 접시에있는 미디어를 교체합니다.
- 퓸 배출 후드에서는 15cm의 접시 미디어 20 ML (1 % 최종 농도)을 540 μL 37 % 포름 알데히드를 추가합니다.
팁 - 틸트 판과 미디어 수영장에 포름 알데히드를 추가 - 다음 바위 플레이트는 균일하게 그것을 확산합니다. - 실온에서 10 분 진행 crosslin....
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토론
명시된 칩 프로토콜은 분석보다보다 20 가지 히스톤 수정을 위해 실험실에서 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 우리는 전사 요소의 숙박 변화를 특징으로 가지고 히스톤 - 수정 IFN - γ 여러 유발 유전자에서 히스톤 수정 및 RNA 효소 II의 전사 기계를 인식 효소, 단백질. 우리는 또한 암 줄기 세포 10 분화 동안 히스톤 수정의 변화를 특징으로 프로 시저를 사용합니다.
칩 데이터의 품질은 궁극적으로 사용되는 항체의 효과에 의존하고 항체 사이에 상당한 변화가 있습니다. 수정을 칩에 실패, 따라서, 그 변경이 존재하지 않습니다라고 의미로 해석될 수 없습니다. 또한, 칩 실험에서 관찰된 특정 수정 변경은 단순히 가까운 잔류물에 추가 히스톤 수정에 의한 항체에 의해 에피토프의 인식에 변화가 반영될 수 있습니다. 따라서, 칩 결과는 생물 학적 결과에 히스톤 수정에서 관찰된 변화와 관련됩니다 접근과 검증해야합니다. 이것이 완료되면, 칩은 유전자 발현의 조절에 기.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 버지니아 대학, 버지니아 암 센터의 대학과 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념 트러스트에 의해 지원됩니다. 우리는 세포 라인에 대한 제임스 E. 다넬 랩 (록펠러 대학교) 로버트 로스 연구실 (포드햄 대학) 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 37% 포름알데히드 | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| 클로로포름/이소아밀 알코올 | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini 프로테아제 억제제 | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic 송아지 혈청 | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| 에탄올 | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| 글라이신 | Roche Group | 100149 | |
| 글리코겐 | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 아세트산 나트륨 | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 데옥시콜산 나트륨염 | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| 페놀/클로로포름/이소아밀 | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| 인산염 완충 식염수 | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| 프로테이나제 K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| 연어 정자 DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| 연어 정자 DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
참고문헌
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on ....
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재인쇄 및 허가
