我们描述了一个反复可视化小鼠小胶质细胞和单核细胞循环的方法<em>在体内</em>超过几小时,几天或几周内,采用经颅双光子显微镜。我们将演示如何编写一个薄的头骨的窗口,让静态的小胶质细胞,激活,可以通过相邻的立体定向注射HIV – 1调控蛋白达间歇观察。
神经科学的传统, 在体内小鼠中枢神经系统的两个光子成像,无论是涉及使用开放性颅骨 1,2或变薄, 颅骨 3准备工作。虽然开颅骨技术是非常灵活,它是研究小胶质细胞最优的,因为它是侵入性,并可能导致小胶质细胞激活。即使颅骨变薄,方法是微创,反复慢性成像所需的头骨重新变薄,增加组织损伤和小胶质细胞激活的风险,并允许数量有限的成像会议。在这里,我们提出一个用于监测小鼠小胶质细胞在体内长时间使用双光子显微镜的时间的慢性颅骨薄窗口的方法。我们演示了如何准备一个稳定,方便,皮质变薄,颅骨窗口(TSCW)apposed仍然超过三个星期的间歇性观察过程中的半透明的玻璃盖玻片。这TSCW准备是远远方面比开放开颅手术或反复颅骨变薄的小胶质细胞激活免疫惰性,并允许在一个星期的时间内任意数量的成像会议。我们准备在CX 3 CR 1 GFP / +小鼠4 TSCW可视化与增强型绿色荧光蛋白≤150下方的软脑膜表面微米的小胶质细胞。我们还表明,该制剂可与HIV – 1蛋白的神经毒性达,毗邻TSCW,这是能够诱导持久microgliosis的立体定向脑注射液配合使用。因此,这种方法是非常有用的研究生活在艾滋病毒有关的神经认知障碍(手)和其他神经退行性疾病与neuroinflammatory组件模型的脑小胶质细胞形态和活力随着时间的推移变化的。
有越来越多的共识,为HIV – 1相关的神经认知赤字(手)的实际基板是突触结构的破坏,大概是从HIV – 1感染单核吞噬细胞释放炎症介质,引起。的小胶质细胞激活,多核巨细胞,胶质细胞增生由于星形胶质细胞肥大,被认为是在中枢神经系统7 HIV – 1感染和炎症的非特异性标志。相比之下,生前神经系统疾病的严重程度已与损失突触的复杂性,以及在中枢神经系统的巨噬细胞8,9,10,11负担。但是,小胶质细胞,周边浸润的巨噬细胞,患者用手的神经元之间的动态交互根本无法使用传统的静态的处理从传统的免疫细胞化学研究取得建模。从我们的实验室最近的研究表明,至少有一些外周和中枢的单核细胞和神经元之间的这些交互可以模拟立体定向注射的HIV – 1蛋白达1-72部分脑实质(路,标记,特朗布莱益气,和格尔巴德,未发表数据)。因此,我们决定申请在体内的双光子成像检查单核细胞衍生的巨噬细胞,脑居民小胶质细胞和神经元之间的相互作用,neuroAIDS一个听话的小动物模型。虽然开放的颅骨或变薄,颅骨准备买得起一个一个时间短暂的时期(小时)皮质架构单一的检查,调查的亚急性事件的时间当然可以不使用不artifactually激活小胶质细胞/巨噬细胞因手术操纵的这些准备工作感兴趣颅骨窗口。在这里,我们展示了一个简单的方法绕过这些限制胶合薄的头骨面积小片,防止再生的颅骨在TSCW以及为≥3个星期保持半透明的玻璃盖玻片。我们进一步证明了这种技术,使我们能够监测在应对艾滋病毒达 1-72立体注射皮质CX 3 CR 1 / GFP的杂合子小鼠外周血单核细胞进入大脑微血管,以及大脑居民的小胶质细胞的行为(确定的单核血统细胞)。这种技术可以很容易地适应使用上具有不同的遗传背景的小鼠,例如,我们经常使用杂合子CX 3 CR 1 / GFP的X THY – 1 YFP的 12只小鼠,以探讨单核细胞衍生的巨噬细胞,脑驻地小胶质细胞和神经元之间的相互作用在体内模型的neuroinflammation有关手。我们TSCW准备允许调查研究之间的周边和中枢神经系统,可能发生在周期间,其中的动物,可反复实验性治疗前后成像的细胞间的相互作用。因此,每个动物可以作为自己的控制。这个TSCW模型的一个需要注意的是,受调查的靶细胞是基因工程表达增强荧光蛋白(eXFP),或与荧光染料没有违反颅骨的机械标记; eXFP表达必须强大到足以使细胞结构可视化后,通过一个星期内重复成像会议。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢刘慧卿凯利头板设计。
我们感谢美国国立卫生研究院奖励支持HAG:RO1 MH56838 MH64570,PO1,RO1 MH078989,R21 MH03851,没有这项工作不可能有贺Waasdorp小儿神经基金的慷慨支持。 AKM的是由美国国立卫生研究院(EY019277),白厅基金,Alfred P. Sloan基金会和在生物医学科学研究所从宝来惠康基金事业奖。 MET是由一个全宗RECHERCHE EN SANTE魁北克(FRSQ)博士后奖。东风是一个在医学科学家培训项目由美国国立卫生研究院的T32 GM07356和T32 AI049815资助,学员。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |