Nous décrivons une méthode pour visualiser plusieurs reprises la microglie et les monocytes circulants murin<em> In vivo</em> Pendant des heures, jours ou semaines à l'aide transcrânienne microscopie à deux photons. Nous démontrons comment préparer une fenêtre amincie crâne qui permet l'observation intermittente de la microglie quiescente qui peut être activé par injection stéréotaxique adjacentes de la Tat du VIH-1 protéine régulatrice.
Traditionnellement, dans les neurosciences, l'imagerie in vivo deux photons du système nerveux central murin a soit impliqué l'utilisation d'open-crâne 1,2 ou amincie crâne 3 préparations. Alors que la technique du crâne ouvert est très polyvalent, il n'est pas optimal pour l'étude de la microglie, car elle est invasive et peut provoquer l'activation microgliale. Même si l'approche éclaircis-crâne est peu invasive, le re-répété amincissement du crâne requises pour l'imagerie chronique augmente les risques de lésion des tissus et l'activation de la microglie et permet à un nombre limité de séances d'imagerie. Nous présentons ici une méthode window chroniques mince crâne pour le suivi des microglies murins in vivo sur une période prolongée de temps en utilisant microscopie à deux photons. Nous démontrons comment préparer une société stable, accessible, amincie crâne fenêtre corticale (TSCW) avec une lamelle de verre revêtue de ce qui reste translucide sur le cours de trois semaines d'observation intermittente. Cette préparation est beaucoup plus TSCW immunologiquement inertes à l'égard de l'activation microgliale que craniotomie ouverte ou le crâne répétées amincissement et permet un nombre arbitraire de sessions d'imagerie au cours d'une période de quelques semaines. Nous préparons TSCW dans CX 3 CR 1 GFP / + 4 souris pour visualiser les microglies avec la protéine fluorescente verte améliorée à ≤ 150 um sous la surface piales. Nous montrons également que cette préparation peut être utilisée en conjonction avec des injections cérébrales stéréotaxiques de la protéine HIV-1 Tat neurotoxiques, adjacent à la TSCW, qui est capable d'induire microgliose durables. Par conséquent, cette méthode est extrêmement utile pour examiner les changements dans la morphologie et la motilité microgliales au fil du temps dans le cerveau vivant dans des modèles de troubles neurocognitifs associés au VIH (main) et d'autres maladies neurodégénératives ayant une composante neuro-inflammatoires.
Il ya un consensus croissant que le substrat réel pour le VIH-1 déficits neurocognitifs associés (MAIN) est la destruction de l'architecture synaptique, probablement causée par médiateurs pro-inflammatoires libérés de VIH-1 phagocytes mononucléaires. L'activation microgliale, des cellules géantes multinucléées, et gliose due à une hypertrophie astrocytaire sont considérés comme caractéristiques non spécifiques du VIH-1 infection et l'inflammation dans les 7 SNC. En revanche, la sévérité de la maladie neurologique premortem a été corrélée à la perte de la complexité synaptique, ainsi que le fardeau des macrophages dans le SNC 8,9,10,11. Cependant, les interactions dynamiques entre la microglie, les macrophages infiltrant périphériques, et les neurones chez les patients atteints MAIN tout simplement ne peuvent pas être modélisés à l'aide conventionnelle de traitement statique obtenue à partir d'études conventionnelles immunocytochimiques. Des études récentes de nos laboratoires ont suggéré qu'au moins certaines de ces interactions entre les périphériques et centraux des cellules mononucléées et les neurones peuvent être modélisés en partie par injection stéréotaxique de la pandémie du VIH-1 dans la protéine Tat 1-72 parenchyme cérébral (Lu, Marker, Tremblay, Qi, et Gelbard, données non publiées). Nous avons donc décidé d'appliquer in vivo deux imagerie photonique afin d'examiner l'interaction entre les dérivées de monocytes macrophages, les microglies du cerveau et les neurones, dans un modèle de petit animal docile pour NeuroSIDA. Alors que les préparatifs en plein crâne ou éclaircis-crâne se permettre un examen unique de l'architecture corticale pendant une brève période de temps (heures), les enquêteurs s'intéressent à l'évolution temporelle des évènements subaiguë pouvez pas utiliser ces préparations sans artifactually activation des microglies / macrophages due à la manipulation chirurgicale de la la fenêtre crânienne. Ici nous démontrons une manière simple de contourner ces limites en collant un petit morceau de lamelle de verre sur la zone du crâne aminci la prévention de la calotte crânienne de se régénérer dans le TSCW ainsi que le maintien de translucidité pour ≥ 3 semaines. Nous avons également démontré que cette technique nous permet de surveiller le comportement des monocytes périphériques entrer microvascularisation cérébrale ainsi que le cerveau-résident microglie en réaction à l'injection stéréotaxique du VIH Tat 1-72 dans le cortex de souris hétérozygotes pour CX 3 CR 1 / GFP ( pour identifier les cellules mononucléées de la lignée). Cette technique peut être facilement adaptée à une utilisation sur des souris avec différentes origines génétiques, par exemple, nous utilisent couramment hétérozygote CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 souris pour étudier les interactions entre les dérivées de monocytes macrophages, les microglies du cerveau et les neurones modèles in vivo de la neuroinflammation pertinentes à la main. Notre préparation TSCW permet aux enquêteurs de l'étude des interactions cellule-cellule entre la périphérie et du SNC qui peuvent survenir sur des périodes de plusieurs semaines, dans lequel l'animal peut être à plusieurs reprises d'image avant et après le traitement expérimental. Ainsi, chaque animal peut servir de son propre contrôle. Une mise en garde pour ce modèle TSCW est que les cellules cibles à l'étude doivent être soit génétiquement pour exprimer des protéines fluorescentes améliorée (eXFP) ou être étiquetés avec un colorant fluorescent, sans rupture mécanique de la calotte crânienne, et que l'expression eXFP doit être suffisamment robuste pour permettent architecture cellulaire pour être visualisées après les séances d'imagerie répétés sur une période de plusieurs semaines.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Emily A. Kelly pour la conception de la plaque la tête.
Nous sommes reconnaissants pour le soutien de subventions des NIH pour HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 et le soutien généreux du Fonds de Geoffrey Waasdorp neurologie pédiatrique, sans lequel ce travail n'aurait pas été possible. AKM est financé par le NIH (EY019277), Whitehall Foundation, la Fondation Alfred P. Sloan et une bourse de carrière dans les sciences biomédicales de l'Burroughs Wellcome Fund. MET est financé par un Fonds de recherche en santé du Québec (FRSQ) de bourses de formation postdoctorale. DFM est un stagiaire du Programme de formation scientifique médical, financé par le NIH T32 et T32 GM07356 AI049815.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fentanyl Citrate | Hospira | |||
Midazolam hydrochloride | Baxter | |||
Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer | |||
Heating pads | Beyond Bodi Heat | |||
Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | |||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | |||
Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | ||
Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | |||
Cyanoacrylate 454 | Loctite | |||
TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | |||
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | ||
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | ||
Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | ||
Cyanoacrylate | The Original Superglue | |||
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | ||
10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments | ILS010LT | ||
UltraMicroPump III | World Precision Instruments | UMP3-1 | ||
35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments | NL35BL-2 | ||
Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | ||
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | ||
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |