Isolatie, Verrijking, en onderhoud van Medulloblastoom Stem Cells
Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie, verrijking en het onderhoud van medulloblastoom tumor stamcellen uit mutante muizen met ectopische Sonic Hedgehog pathway activiteit.
Abstract
Hersentumoren zijn voorgesteld om een kleine populatie van stamcellen die zijn de oorzaak van het ontstaan van tumoren bezitten. Neurosphere assays zijn over het algemeen genomen de aard van neurale stamcellen, waaronder die zijn afgeleid van normale en tumor weefsel te bestuderen. Echter, aanzienlijke hoeveelheden van differentiatie en celdood komen vaak voor bij gekweekte neurospheres waarschijnlijk te wijten aan sub-optimale conditie, zoals de toegankelijkheid van alle cellen binnen het werkingsgebied van aggregaten kweekmedium.
Medulloblastoom, de meest voorkomende tumor bij kinderen CNS, wordt gekenmerkt door zijn snelle progressie en de neiging zich te verspreiden langs de gehele hersen-spinale as met sombere klinische uitkomst. Medulloblastoom is een neuro-epitheliale tumor van het cerebellum, goed voor 20% en 40% van de intracraniële en posterior fossa tumor in de kindertijd, respectievelijk 1. Het is nu bekend dat Shh signalering de proliferatie van cerebellaire granule neuron precursoren (CGNPs) stimuleert tijdens de ontwikkeling van het cerebellum 2-4. Tal van studies met behulp van muismodellen, waarin de Shh pad constitutief geactiveerd is, zijn gekoppeld Shh signalering met medulloblastoom 5-9.
Een recent rapport heeft aangetoond dat een subset van medulloblastoom cellen afkomstig van Patched1 LacZ / + muizen zijn kanker stamcellen, die in staat zijn het initiëren en propogating tumoren 10. Hier beschrijven we een efficiënte methode te isoleren, te verrijken en te onderhouden tumor stamcellen afkomstig van verschillende muismodellen van medulloblastoom, met constitutief geactiveerde Shh weg als gevolg van een mutatie in gladgestreken (11, hierop aangeduid als SmoM2), een GPCR dat essentieel is voor Shh weg activering. In elke geïsoleerde medulloblastoom weefsel, waren we in staat om een groot aantal zeer proliferatieve kolonies vast te stellen. Deze cellen robuust uitgedrukt verschillende neurale stamcellen merkers zoals Nestin en Sox2, kunnen ondergaan seriële passages (groter dan 20) en werden Monogene. Hoewel deze gekweekte tumorcellen stamcellen waren relatief kleine, vaak bipoar met een hoge nucleair cytoplasma-ratio indien gekweekt onder omstandigheden gunste van stamcellen groei, zien zij dramatisch veranderd hun morfologie, uitgebreid met meerdere cellulaire processen, afgeplat en trok zich terug uit de celcyclus bij overschakelen naar een cel kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum. Wat nog belangrijker is, deze tumor stamcellen gedifferentieerd in Tuj1 + of Neun + neuronen, GFAP + astrocyten en oligodendrocyten CNPase +, waardoor de nadruk leggend op multi-potentie. Bovendien zijn deze cellen in staat waren van teeltmateriaal secundaire medulloblastomen wanneer orthotopically getransplanteerd in muizen gastheer.
Protocol
Discussion
We beschrijven een efficiënte manier te isoleren, te verrijken en te onderhouden medulloblastoom stamcellen uit de primaire tumor weefsel opgehaald uit mutante muizen met een constitutief actieve Hedgehog signalering. Wij vonden dat een belangrijke stap in de succesvolle oprichting van een gezonde tumor stamcel lijn is de Accutase behandeling gebruikt tijdens de dissociatie van de primaire tumor weefsel. In onze ervaring, bij de eerste distantiëren tumorweefsel van het cerebellum, 4 minuten 50% Accutase behandeling bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), de Childhood Brain Tumor Foundation en het National Institutes of Health (NS042205).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | ||
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X | |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X | |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% | |
| Gelatin | Sigma | G1393 | 0.1% | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM | |
| Primaria dishes | Fisher | 087724C | ||
| Sox2 antibody | Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 | |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 | |
| YFP antibody | Molecular Probes | A11122 | Rabbit, 1:2000 | |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 | |
| Tuj1 antibody | Sigma | T5076 | Mouse, 1:2000 | |
| NeuN antibody | Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 | |
| CNPase antibody | Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G. Medullablastoma Stem Cells. J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O’Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. The Origins of Medulloblastoma Subtypes. Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
