Enriquecimento de isolamento, e Manutenção de Células-Tronco Meduloblastoma
Summary
Este protocolo descreve o isolamento, enriquecimento e manutenção das células do tumor meduloblastoma-tronco derivadas de camundongos mutantes com ectópica atividade da via sonic hedgehog.
Abstract
Tumores cerebrais têm sido sugeridos para possuir uma pequena população de células-tronco que são a causa raiz de tumorigênese. Neurosphere ensaios têm sido geralmente adotado para estudar a natureza das células-tronco neurais, incluindo aquelas derivadas de tecidos normais e tumorais. No entanto, quantidades apreciáveis de diferenciação e morte celular são comuns na cultura neurospheres provavelmente devido ao sub-ótimas condições tais como a acessibilidade de todas as células dentro de agregados esfera para meio de cultura.
Meduloblastoma, o tumor mais comum do SNC pediátrica, é caracterizada pela sua rápida progressão e tendência a se espalhar ao longo do eixo cérebro-espinhal inteira com o resultado clínico sombrio. Meduloblastoma é um tumor neuroepiteliais do cerebelo, responsável por 20% e 40% dos tumores intracranianos e fossa posterior na infância, respectivamente 1. É agora bem estabelecido que a sinalização Shh estimula a proliferação de precursores granulares do cerebelo neurônio (CGNPs) durante o desenvolvimento do cerebelo 2-4. Numerosos estudos utilizando modelos de ratos, em que a via de Shh é constitutivamente ativado, ligaram sinalização Shh com meduloblastoma 5-9.
Um relatório recente mostrou que um subconjunto de células derivadas de meduloblastoma Patched1 ratos LacZ / + são as células-tronco cancerosas, que são capazes de iniciar e propogating tumores 10. Aqui nós descrevemos um método eficiente para isolar, enriquecer e manter células-tronco tumorais derivados de modelos do rato várias meduloblastoma, com constitutivamente ativado via de Shh devido a uma mutação no Smoothened (11, doravante referida como SmoM2), um GPCR, que é fundamental para Shh ativação da via. Em todos os tecidos meduloblastoma isoladas, foram capazes de estabelecer numerosas colônias altamente proliferativa. Estas células robustamente expressa vários marcadores de células-tronco neurais, tais como nestina e Sox2, pode sofrer passagens em série (maior que 20) e foram clonogênica. Embora essas células-tronco cultivadas tumor eram relativamente pequenos, muitas vezes com bipoar nuclear elevada relação entre citoplasmática quando cultivadas em condições favorecendo o crescimento de células-tronco, que alterou drasticamente sua morfologia, estendida vários processos celulares, achatada e retirou-se do ciclo celular após a mudança para uma célula meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino. Mais importante, estas células-tronco tumorais diferenciado em Tuj1 + ou + NeuN neurônios, astrócitos GFAP + e + CNPase oligodendrócitos, ressaltando assim a sua potência multi-. Além disso, essas células eram capazes de propagar meduloblastomas secundário quando ortotopicamente transplantadas em camundongos host.
Protocol
Discussion
Descrevemos uma forma eficiente para isolar, enriquecer e manter as células-tronco do tecido meduloblastoma tumor primário recuperados de camundongos mutantes com constitutivamente ativa Hedgehog sinalização. Descobrimos que um passo crítico no sucesso estabelecer uma linha saudável tumor de células-tronco é o tratamento Accutase usado durante a dissociação do tecido do tumor primário. Em nossa experiência, quando o tecido do tumor primeiro dissociar do cerebelo, 4 minutos de tratamento Accutase 50% a 37 ° …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por concessões do Vanderbilt-Ingram Cancer Center de Suporte Grant (P30 CA068485), a Childhood Foundation tumor cerebral e os Institutos Nacionais de Saúde (NS042205).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | ||
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X | |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X | |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% | |
| Gelatin | Sigma | G1393 | 0.1% | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM | |
| Primaria dishes | Fisher | 087724C | ||
| Sox2 antibody | Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 | |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 | |
| YFP antibody | Molecular Probes | A11122 | Rabbit, 1:2000 | |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 | |
| Tuj1 antibody | Sigma | T5076 | Mouse, 1:2000 | |
| NeuN antibody | Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 | |
| CNPase antibody | Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
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