Medulloblastom Kök Hücreleri İzolasyon, Zenginleştirme ve Bakım
Summary
Bu protokol, izolasyon, zenginleştirme, ektopik Sonic hedgehog yolu aktivite ile mutant farelerde elde edilen medulloblastom tümör kök hücreler bakım ve açıklar.
Abstract
Beyin tümörleri Tümörgenez kök neden olan kök hücreler küçük bir nüfusa sahip öne sürülmüştür. Neurosphere testleri genellikle normal ve tümöral dokuların elde edilenler dahil olmak üzere nöral kök hücreler, doğayı incelemek için kabul edilmiştir. Ancak, kayda değer miktarda farklılaşması ve hücre ölümüne kürenin agrega içinde tüm hücrelerin kültür ortamı erişilebilirlik gibi sub-optimal durum muhtemelen nedeniyle kültür neurospheres yaygındır.
Medulloblastom, en sık görülen pediatrik merkezi sinir sistemi tümörü, hızlı ilerlemesi ve kasvetli klinik sonuç ile tüm beyin-omurilik ekseni boyunca yayılma eğilimi ile karakterize. Medulloblastom 1 sırasıyla% 20 ve% 40, çocukluk çağında intrakranial ve posterior fossa tümörü için muhasebe, beyinciğin bir nöroepitelyal tümör . Şimdi iyi Shh sinyalizasyon serebellar gelişim 2-4 sırasında serebellar granül nöron öncüleri (CGNPs) yayılması uyarır kurulmuştur. Çeşitli çalışmalar, Shh yolu yapısal olarak aktif olan fare modelleri kullanarak medulloblastom 5-9 Shh sinyalizasyon bağlantılı.
Yeni bir rapor Patched1 LacZ / + fareler türetilen medulloblastom hücrelerinin tümörleri 10 başlatılması ve propogating yeteneğine kanser kök hücreleri, bir alt kümesi olduğunu göstermiştir. Burada Smoothened içinde bir mutasyon (11 hereon SmoM2 olarak anılacaktır), Shh için kritik bir GPCR nedeniyle yapısal olarak aktive Shh yolağı, medulloblastom birkaç fare modelleri türetilmiş tümör kök hücreleri izole zenginleştirmek ve korumak için etkili bir yöntem tarif yolağı aktivasyonu. Her izole medulloblastom dokusu, çok sayıda yüksek proliferatif koloniler kurmayı başardık. Bu hücreler, sağlam Nestin ve Sox2 gibi çeşitli sinir kök hücre belirteçleri ifade seri pasajlar tabi (20'den fazla) ve clonogenic edildi. Bu kültür tümör kök hücreler, kök hücre büyüme lehine koşullar altında kültüre sitoplazmik oranı yüksek nükleer ile sık sık bipoar nispeten küçük iken, bu ölçüde, kendi morfolojisi değiştirdi birden fazla hücre sürecinin genişletilmiş, basık ve bir hücreye geçiş üzerine hücre döngüsü çekildi kültür ortamı,% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir. Daha da önemlisi, bu tümör kök hücreler Tuj1 ayrılabilir + veya Neun + nöronlar, GFAP + astrositler ve CNPase + oligodendrosit, böylece onların çok potens vurgulayarak. Ayrıca, bu hücreler orthotopically ana farelere nakledilen zaman ikincil medülloblastomlar yayma yeteneğine sahip.
Protocol
Discussion
Medulloblastom kök hücreleri yapısal olarak aktif Kirpi sinyalizasyon ile mutant farelerde alınan birincil tümör dokusundan izole zenginleştirmek ve korumak için etkili bir şekilde açıklar. Biz, başarılı, sağlıklı bir tümör kök hücre hattı kurulması bir kritik adım birincil tümör dokusu disosiasyon sırasında kullanılan Accutase bir tedavi olduğunu bulundu. Bizim tecrübelerimize göre, beyincik ilk dissociating tümör dokusu, 4 dakika 37% 50 Accutase tedavi ° C, 1 ml Pipetman kullanarak g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada, Vanderbilt-Ingram Kanser Merkezi Destek Hibe (P30 CA068485), Çocukluk Çağı Beyin Tümörü Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NS042205) hibe ile desteklendi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | ||
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X | |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X | |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% | |
| Gelatin | Sigma | G1393 | 0.1% | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM | |
| Primaria dishes | Fisher | 087724C | ||
| Sox2 antibody | Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 | |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 | |
| YFP antibody | Molecular Probes | A11122 | Rabbit, 1:2000 | |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 | |
| Tuj1 antibody | Sigma | T5076 | Mouse, 1:2000 | |
| NeuN antibody | Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 | |
| CNPase antibody | Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G. Medullablastoma Stem Cells. J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O’Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. The Origins of Medulloblastoma Subtypes. Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
