Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat

Summary

Nous démontrons un protocole pour l'isolement du nerf axoplasme sciatique de rat adulte repose sur la dissection des fascicules nerveux et l'incubation dans le milieu hypotonique pour libérer de la myéline et Lyse non axonale structures, suivie de l'extraction de l'axone reste-matériau enrichi.

Abstract

Isolement du cytoplasme axonal pur (axoplasme) de nerf périphérique est cruciale pour les études biochimiques de nombreux processus biologiques. Dans cet article, nous démontrons et décrire un protocole pour l'isolement du nerf axoplasme sciatique de rat adulte sur la base des étapes suivantes: (1) la dissection des fascicules nerveux et la séparation des tissus conjonctifs; (2) incubation de courts segments de fascicules nerveux au milieu hypotonique pour libérer de la myéline et Lyse non axonale des structures, et (3) l'extraction de l'axone reste-matériau enrichi. Caractérisation protéomique et biochimique de cette préparation a confirmé un haut degré d'enrichissement pour les composants axonale.

Protocol

Ce protocole permet l'isolement axoplasme avec minimisation de la contamination tissu glial et vasculaire. La méthode des rendements d'environ 70 à 100 mg de protéines totales par axoplasme une semaine de 80 à 10 Wistar vieux rat. 1. Disséquer nerfs sciatiques Euthanasier deux rats par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale. Confirmer la mort par la palpation de l'absence de battement avant la dissection début. Nettoyer la zone d…

Discussion

Les analyses biochimiques et protéomiques ont confirmé que cette procédure réduit la contamination de cellules gliales sérum et ³ par rapport aux méthodes décrites précédemment pour l'isolement axoplasme de Squeeze mécanique ^1. Nous avons utilisé ce protocole d'isolement axoplasme à explorer dynéine basé signalisation rétrograde après lésion du nerf sciatique ^2, et s'attendre à ce qu'il ont une utilité dans l'exploration de nombreux autres processus…

Materials

• Male Wistar rats (8-10 weeks old)
• PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml
• Eppendorfs for 1.5 ml
• Sterilized plastic dishes 35 mm
• Dissecting tools including: scissors and fine forceps
• Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).