Summary
A atividade da descarboxilase induzível lisina é monitorado pela reação do substrato L-lisina e cadaverina o produto com 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-ácido para formar adutos que têm solubilidade diferencial em tolueno.
Abstract
A Escherichia coli é uma bactéria entérica que é capaz de crescer em uma ampla faixa de valores de pH (pH 5-9) 1 e, incrivelmente, é capaz de sobreviver ácido extremo frisa, incluindo a passagem pelo estômago de mamíferos, onde o pH pode cair para valores tão baixos como pH 1 - 2 2. Para habilitar a um leque tão amplo de sobrevivência pH ácido, E. coli possui quatro diferentes induzível decarboxylases aminoácido que decarboxylate ácidos seu substrato aminoácidos de uma maneira próton-dependentes elevando o pH interno. O decarboxylases incluem o ácido glutâmico decarboxylases Gada e GadB 3, a arginina descarboxilase Adia 4, a lisina descarboxilase LdcI 5, 6 e ornitina decarboxilase SpeF 7. Todas essas enzimas utilizam piridoxal-5'-fosfato como um co-fator 8 e funcionam em conjunto com a membrana interna-substrato-produto antiporters que remover produtos descarboxilação ao meio externo, em troca de substrato fresco 2. No caso de LdcI, o antiporter lisina cadaverina é chamado CADB. Recentemente, nós determinamos a estrutura de cristal de raios-X de LdcI a 2,0 Å, e nós descobrimos um romance de pequenas moléculas obrigado a LdcI o regulador de guanosina 5'-difosfato rigorosos resposta, difosfato-3'(ppGpp) 14. A resposta severas ocorre quando as células em crescimento exponencial experiência de privação de nutrientes ou uma de uma série de outros estresses 9. Como resultado, as células produzem ppGpp que leva a uma cascata de sinalização que culminou com a mudança de crescimento exponencial para o crescimento da fase estacionária 10. Nós demonstramos que ppGpp é um inibidor específico da LdcI 14. Aqui nós descrevemos o ensaio descarboxilase lisina, modificado a partir do ensaio desenvolvido por Phan et al. 11, que temos usado para determinar a atividade de LdcI eo efeito de pppGpp / ppGpp essa actividade. A reação de descarboxilação LdcI remove o grupo α-carboxila de L-lisina e produz dióxido de carbono ea cadaverina poliamina (1,5-diaminopentane) 5. L-lisina e cadaverina pode ser reagido com ácido 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) em pH elevado para gerar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), respectivamente 11. O TNP-cadaverina podem ser separados do TNP-lisina como o primeiro é solúvel em solventes orgânicos como o tolueno, enquanto o último não é (ver Figura 1). A faixa linear do ensaio foi determinada empiricamente usando purificada cadaverina.
Protocol
1) Reagentes e Equipamentos
- Primeiro, prepare as três seguintes soluções: 1 mL de uma solução que é composta de 8 mM L-lisina, 100 mM de sódio 2 - (N-Morfolino) ethanesulphonic ácido (MES) pH 6,5, 0,2 mM de nucleotídeos, onde o nucleotídeo é ou: difosfato de guanosina (GDP), o trifosfato de guanosina (GTP), guanosina 5'-difosfato, difosfato-3'(ppGpp), ou guanosina 5'-trifosfato, difosfato-3'(pppGpp), 0,1 mM piridoxal-5'-fosfato (PLP), e 1 mM β-mercaptoetanol / (β-ME). 1 mL da solução B, que consiste em sódio 100 mM MES pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME, e 50 nM LdcI. LdcI foi purificada como descrito no Snider et al. 6 e Kanjee et al. 14.
1 mL da solução C que é idêntico a Solução B, mas não contém LdcI. - Prepare 100 mL da solução de parada consistindo de um carbonato de sódio M (10,6 g/100 mL) e alíquota de 50 mL em cada poço de uma placa de poliestireno de 96 poços, utilizando uma pipeta multi-canal. Adicionar 30 mL de água para a placa e em seguida, cobrir. Note que a soma do volume de água adicionada e do volume de amostra extraída durante a reação enzimática deve ser igual a 50 mL. Neste caso, 20 mL de amostra reação enzimática será removido.
- Prepare 5 mL de solução TNBS em 10 mM diluindo 294 mL de 5% (w / v) ações TNBS com 4706 mL de água, embrulhe em papel alumínio e mantenha no gelo.
- Equilibrar a ThermoStat Eppendorf Além disso, a 37 ° C. O Plus ThermoStat tem 24 poços em seis colunas. Veja a Figura 2 para esquemática. Rótulo 1,5 mL tubos Eppendorf indicando a identidade do nucleotídeo, que será testado (um por coluna): GTP (coluna A), o PIB (coluna B), ppGpp (coluna C), pppGpp (coluna D), não nucleotídeo (coluna E ), e amostras de proteínas (coluna F).
- Caixas de rack de várias dicas de 200 mL de tal forma que cada linha alternativa é omitido dando um total de quatro linhas de dicas. Isso é necessário para o uso da pipeta multi-canal com o termostato heatblock Além disso, durante o ensaio enzimático.
- Equilibrar Digital Heatblock (VWR) a 42 ° C.
- Coloque um de 96 poços da placa de polipropileno 2,0 mL sobre o gelo para esfriar.
2) Ensaio LdcI
- Alíquota de 50 mL de uma solução com o nucleotídeo apropriada para tubos de 1,5 mL Eppendorf em cada uma das cinco colunas do termostato Eppendorf.
- Adicionar 330 mL da solução B para três tubos na coluna F e adicione 330 ml de solução C (o controle não-proteína) ao tubo finais na coluna F.
- Equilibrar as soluções a 37 ° C por cinco minutos. Dica: depois de 5 minutos, corte as tampas dos tubos no centro do bloco de aquecimento para impedi-los de interferir com a pipeta multicanal para ser utilizado próximo.
- Usando um 50-50 mL VWR multi-canal de pipeta, 50 mL de transferência dos tubos na coluna F para cada um dos tubos em colunas AE. Iniciar o cronômetro assim que o primeiro tubo é misturado.
- Aos 2, 4 e 6 minutos retirar 20 mL de amostra usando a pipeta multi-canal e adicionar à solução de parada.
- Nota: as amostras em solução de parada pode ser percorrida em filme plástico e congeladas a -20 ° C para posterior processamento. As placas devem ser descongeladas em temperatura ambiente antes da reação com TNBS.
3) Reação TNBS e Desenvolvimento Cor
- Adicionar 50 mL de solução de 10 mM TNBS para a solução parar de usar a pipeta multi-canal e, em seguida, incubar a 42 ° C por 6 minutos. A solução vai virar uma cor amarelo escuro / laranja como o TNBS reage com a lisina ea cadaverina.
- Após 6 minutos, arrefecer a placa de gelo para diminuir a reação.
- Remover 100 mL de amostra com uma pipeta VWR 2-20 multi-canal L e lugar na 2 mL prato fundo bem que foi resfriado em gelo. Transferência balde de gelo para o fumehood.
- Adicionar 500 mL de tolueno em cada cavidade utilizando um HandyStep (Marca) pipetador de repetição e 12,5 mL pipeta ponta (PLASTIBRAND).
- Limpe qualquer excesso de tolueno usando um kimwipe e cobrir o prato com tiras de fita de embalagem. Certifique-se de pressionar firmemente para obter uma boa vedação. Cobrir a placa de 96 poços com uma tampa plana e, em seguida, agitar vigorosamente por 1 minuto e 30 segundos.
- Deixe as soluções para resolver durante 5 minutos. O TNP-cadaverina está agora na fase superior tolueno, enquanto que o TNP-lisina permanece solúvel em água (ver Figura 1).
- Remover 200 mL de tolueno usando a 20-200 pipeta multi-canal mL em uma placa de 96 poços para leitura. Nota: certifique-se de verificar que cada amostra está sendo removido é clara e não tem qualquer fundo da fase aquosa. Nota: Dicas de uso de barreira para evitar danos ao multi-canal de pipeta pelo tolueno.
- Ler a absorvância a 340 nm em um leitor de placas SpectraMax 340.
- Para limpar a placa de quartzo, lavar o tolueno com água e colocar a placa de quartzo em um grandebandeja de vidro na capela. Despeje sobre 100 mL de uma mistura 07:03 de 70% (v / v) de ácido nítrico: 95% (v / v) etanol e cobrir a placa de quartzo com uma bandeja de vidro segundo. Atenção: a reação é altamente exotérmica proteção contra o desgaste e às vezes explosiva apropriadas e assegurar que a folha capela está definido para o menor nível 6 "Após arrefecimento, lavar o ácido nítrico com água e depois 95% de etanol..
4) Resultados Representante
1) cadaverina Curva padrão (Figura 3)
O ensaio foi realizado como descrito, mas sem qualquer L-lisina ou LdcI e concentrações em vez de vários cadaverina foram usados para determinar empiricamente a faixa linear do ensaio. O ensaio foi linear para um OD 340 de 0,25, correspondendo a ~ 22 nmoles de cadaverina (Figura 3).
Atividade 2) de LdcI (Figura 4)
A atividade de LdcI sozinho estava determinado a ser 153,5 (± 18,1) nmoles cadaverina min-1 mg LdcI-1 em pH 6,5. A atividade de LdcI não é afetada na presença de 100 mM GTP ou GDP, mas é fortemente inibida (> 10 vezes) na presença de pppGpp e ppGpp (Figura 4).
Figura 1. Esquema da reação LdcI. A reação de descarboxilação de L-lisina para gerar CO 2 e cadaverina é mostrado, assim como a reação subseqüente com TNBS em pH elevado para gerar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N '-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina). Baseado em Phan et al.11
Figura 2. Configuração do termostato Eppendorf. O layout das amostras no ThermoStat Eppendorf de 24 poços é mostrada junto com a descrição das etapas do ensaio (indicado em negrito). As setas indicam a transferência de soluções de reação de acordo com o protocolo. Remoção da solução de reação à solução de parada na placa de 96 poços também é indicado.
Figura 3. Cadaverina curva padrão. Um gráfico de absorvância a 340 nm contra nmoles de cadaverina é mostrado. Barras de erro representam o desvio padrão de pelo menos três medições independentes. A linha de melhor ajuste também é mostrada e tem um R2 de 0,996.
Figura 4. Os resultados do ensaio LdcI. Um gráfico da taxa de atividade LdcI (em nmoles cadaverina produzido min-1 g-1 LdcI) é mostrada na presença de 100 mM GTP, GDP, pppGpp, ppGpp e na ausência de nucleotídeos. Os nucleotídeos resposta rigorosa (p) ppGpp são capazes de inibir significativamente a atividade LdcI. As barras de erro representam o desvio padrão de pelo menos seis medições independentes.
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Discussion
No ensaio descarboxilase lisina, TNBS é reagido com as aminas primárias de L-lisina e cadaverina para formar TNP-lisina e cadaverina TNP-adutos (Figura 1). Devido à presença do grupo de ácido carboxílico em TNP-lisina, este permanece aduto solúvel em água, enquanto o TNP-cadaverina, faltando o grupo ácido carboxílico, é capaz de particionamento em tolueno 11. Este tipo de ensaio pode ser utilizado de forma mais ampla em outros tipos de aminoácidos, onde a perda de um grupo de ácido carboxílico ocorre durante a reação. Isso ocorre durante a descarboxilação da L-ornitina pela SpeF ornitina descarboxilase induzível para formar a putrescina poliamina 7 ea descarboxilação da L-arginina pela arginina descarboxilase induzível Adia para formar a agmatina poliamina 4.
O ensaio aqui descrito LdcI fornece um método relativamente rápido para a determinação da atividade da proteína purificada in vitro. As principais vantagens deste teste são:
i) Utilização de múltiplas repetições por experimento melhora a precisão de cada medida;
ii) O ensaio pode ser conduzido em uma ampla gama de condições de tampão (pH diferente, sal, agente redutor, etc), sem modificação do protocolo;
iii) O ensaio pode ser modificado para medir a atividade in vivo de LdcI determinando a quantidade de cadaverina excretado durante o crescimento celular.
As principais limitações deste ensaio são:
i) A sensibilidade dos experimentos são limitados pela faixa linear de absorbância do TNP-adutos;
ii) As etapas de processamento múltiplas aumentam a magnitude dos erros experimentais;
iii) Nem todos os decarboxylases aminoácidos são passíveis a este tipo de protocolo. Por exemplo, a descarboxilação do ácido L-glutâmico pela induzível decarboxylases ácido glutâmico Gada / GadB gera γ-amino-butírico 2, o TNBS aduto de que será solúvel em água, devido à presença do ácido carboxílico de cadeia lateral grupo.
A investigação bioquímica da resposta ao estresse ácido de E. coli é uma expansão da área de pesquisa e vai nos permitir entender melhor a base molecular da resposta ao estresse em E. e Escherichia relacionadas γ-proteobactérias que têm sistemas semelhantes de ácido resposta ao estresse, tais como Salmonella enterica serovar Typhimurium 12 e cólera Vibrio 13. A descoberta de que a atividade LdcI é inibida pela ppGpp rigorosos resposta do regulador nos proporcionou uma visão até então desconhecida para a regulação dessa proteína.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA) por enviar cepas de bactérias, plasmídeos, e protocolos necessários. Agradecemos ao Dr. John Glover (Department of Biochemistry, University of Toronto) para uso do leitor de placas SpecraMax. Reino Unido é o destinatário de uma National Ciências e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC) Bolsa de Pós-Graduação, a Canadian Institutes of Health Programa de Formação de Investigação Estratégica na Biologia Estrutural de Proteínas de Membrana ligados à doença, e da Universidade de Toronto Fellowship Open. Este trabalho foi financiado por uma doação do Canadian Institutes of Health Research (MOP-67210) para WAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
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