Summary
De activiteit van de induceerbare lysine decarboxylase wordt gecontroleerd door de reactie van het substraat L-lysine en het product cadaverine met 2,4,6-trinitrobenzensulfonic zuur te adducten dat differentiële oplosbaarheid hebben in tolueen vorm.
Abstract
Escherichia coli is een enterische bacterie die in staat is te groeien over een breed bereik van pH waarden (pH 5 - 9) 1 en, ongelooflijk, is in staat om extreem zuur spanningen onder passage door de maag zoogdieren, waar de pH-waarde kan vallen overleven tot een zo laag als pH 1 tot 2 februari. In staat te stellen een breed assortiment van zure pH te overleven, E. coli beschikt over vier verschillende induceerbare aminozuur decarboxylasen dat decarboxyleren hun substraat aminozuren in een proton-afhankelijke manier dus ook de interne pH verhogen. De decarboxylasen zijn de glutaminezuur decarboxylasen Gada en GadB 3, de arginine decarboxylase Adia 4, van de lysine decarboxylase LdcI 5, 6 en de ornithinedecarboxylase SPEF 7. Al deze enzymen maken gebruik van pyridoxal-5'-fosfaat als een co-factor 8 en werken samen met binnen-membraan substraat-product antiporters dat decarboxylering producten te verwijderen om de externe medium in ruil voor verse ondergrond 2. In het geval van LdcI, is de lysine-cadaverine antiporter Cadb genoemd. Onlangs hebben we de X-ray kristalstructuur van LdcI tot 2,0 Å, en ontdekten we een nieuwe klein-molecule gebonden aan de strenge LdcI reactie regulator guanosine 5'-difosfaat, 3'-difosfaat (ppGpp) 14. De strenge reactie treedt op wanneer exponentieel groeiende cellen ervaring voedingsstof deprivatie of een van een aantal andere belastingen 9. Als gevolg hiervan, cellen produceren ppGpp die leidt tot een signaalcascade culminerend in de verschuiving van exponentiële groei naar stationaire fase groei 10. We hebben aangetoond dat ppGpp is een specifieke remmer van LdcI 14. Hier beschrijven we de lysine decarboxylase assay, gewijzigd ten opzichte van de test is ontwikkeld door Phan et al.. 11, die we hebben gebruikt om de activiteit van LdcI en het effect van pppGpp / ppGpp op die activiteit te bepalen. De LdcI decarboxyleringsreactie verwijdert de α-carboxy groep van L-lysine en produceert kooldioxide en de polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane) 5. L-lysine en cadaverine kan worden gereageerd met 2,4,6-trinitrobenzensulfonic zuur (TNBS) bij hoge pH-waarde N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) en N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine) te genereren, respectievelijk 11. Het TNP-cadaverine kan worden gescheiden van de TNP-lysine als de eerste is oplosbaar in organische oplosmiddelen, zoals tolueen, terwijl de laatste is niet (zie figuur 1). Het lineaire bereik van de test werd bepaald met behulp van empirisch gezuiverd cadaverine.
Protocol
1) Reagentia en apparatuur
- De eerste, de voorbereiding van de volgende drie oplossingen: 1 ml oplossing A die bestaat uit 8 mM L-lysine, 100 mM natrium-2 - (N-morfolino) ethanesulphonic zuur (MES) pH 6,5, 0,2 mM nucleotide, waarbij de nucleotide is ofwel: guanosine difosfaat (BBP), guanosine trifosfaat (GTP), guanosine 5'-difosfaat, 3'-difosfaat (ppGpp), of guanosine 5'-trifosfaat, 3'-difosfaat (pppGpp), 0,1 mM pyridoxal-5'-fosfaat (PLP), en 1 mM β-mercapto-ethanol / (β-ME). 1 ml oplossing B, die bestaat uit 100 mM natrium-MES pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME, en 50 nM LdcI. LdcI werd gezuiverd zoals beschreven in Snider et al.. 6 en Kanjee et al.. 14.
1 ml oplossing C die identiek is aan Oplossing B, maar bevat geen LdcI. - Bereiding van 100 ml van de stop-oplossing die bestaat uit een M natriumcarbonaat (10,6 g/100 ml) en 50 pi aliquot in elke well van een 96-well plaat polystyreen met behulp van een multi-channel pipet. Voeg 30 pi van het water aan de plaat en daarna te dekken. Merk op dat de som van de hoeveelheid water toegevoegd en het volume van het monster onttrokken tijdens het enzym reactie moet 50 pi gelijk zijn. In dit geval wordt 20 ul van enzymreactie monster worden verwijderd.
- Bereid 5 ml TNBS oplossing bij 10 mM door het verdunnen van 294 pi van 5% (w / v) TNBS voorraad met 4706 pi water, wikkel in aluminiumfolie en houd op ijs.
- Evenwicht van de Eppendorf Thermostaat Plus bij 37 ° C. De thermostaat Plus heeft 24 bronnen in 6 kolommen. Zie figuur 2 voor schema. Label 1.5 ml Eppendorf buisjes met vermelding van de identiteit van de nucleotide die zal worden getest (een per kolom): GTP (kolom A), het BBP (kolom B), ppGpp (kolom C), pppGpp (kolom D), geen nucleotide (kolom E ), en eiwit monsters (kolom F).
- Rek een aantal dozen van 200 pi tips zodanig dat elke rij afwisselend wordt weggelaten geeft een totaal van vier rijen van tips. Dit is nodig voor het gebruik van de multi-channel pipet met de thermostaat Plus heatblock tijdens het enzym assay.
- Equilibreren Digital Heatblock (VWR) bij 42 ° C.
- Plaats een 96-wells 2,0 ml polypropyleen plaat op ijs om af te koelen.
2) LdcI Assay
- Aliquot 50 ul van Oplossing A met de juiste nucleotide tot 1,5 ml Eppendorf buizen in elk van de vijf zuilen van de Eppendorf thermostaat.
- Voeg 330 ul van Oplossing B tot drie buisjes in kolom F en voeg 330 ul van Solution C (de no-eiwit controle) aan de laatste buis in kolom F.
- Evenwicht van de oplossingen bij 37 ° C gedurende vijf minuten. Tip: na 5 minuten, sneed de doppen van de buizen in het midden van de verwarming-blok om te voorkomen dat ze interfereren met de multichannel pipet naar de volgende worden gebruikt.
- Met behulp van een 5-50 ul VWR multi-channel pipet 50 pi van de buizen in kolom F in elk van de buizen in kolommen AE. Start de timer zodra de eerste buis gemengd is.
- Op 2, 4, en 6 minuten te verwijderen 20 pi van het monster met behulp van de multi-channel pipet en toe te voegen aan de stop-oplossing.
- Let op: monsters in stop oplossing kan worden bedekt met plastic wrap en ingevroren bij -20 ° C voor verdere verwerking. De platen moeten worden ontdooid op kamertemperatuur voordat u reactie met TNBS.
3) TNBS Reaction en kleurontwikkeling
- Voeg 50 ul van 10 mM TNBS oplossing voor het stoppen oplossing met behulp van de multi-channel pipet en vervolgens incuberen bij 42 ° C gedurende 6 minuten. De oplossing zal blijken een donker geel / oranje kleur als de TNBS reageert met de lysine en cadaverine.
- Na 6 minuten, koel de plaat op het ijs te vertragen de reactie.
- Verwijder de 100 ul van het monster met behulp van een geregistreerde 20-200 pi multi-channel pipet en plaats in de 2 ml diepe put plaat die werd gekoeld op ijs. Transfer ijs-bucket naar de fumehood.
- Voeg 500 ui tolueen aan elke well met behulp van een HandyStep (Brand) herhalen pipet en 12,5 mL pipet tip (PLASTIBRAND).
- Veeg overtollige tolueen met behulp van een kimwipe en bedek de plaat met stroken van verpakkingen tape. Zorg ervoor dat u stevig aandrukken om een goede afdichting te verkrijgen. Dek de 96-wells plaat met een vlakke deksel en dan schud krachtig gedurende 1 minuut en 30 seconden.
- Laat de oplossingen om zich te vestigen gedurende 5 minuten. Het TNP-cadaverine is nu in de bovenste tolueen-fase, terwijl de TNP-lysine blijft in water oplosbaar (zie figuur 1).
- Verwijder de 200 pi van tolueen het gebruik van de 20-200 pi multi-channel Pipetteer in een 96-wells plaat voor het lezen. Let op: zorg ervoor om te controleren of elk monster wordt verwijderd duidelijk is en heeft geen van de onderste waterige fase. Opmerking: Gebruik barrière tips om schade aan de multi-channel pipet te voorkomen door de tolueen.
- Lees de absorptie bij 340 nm in een SpectraMax 340 plaat lezer.
- Voor het reinigen van het kwarts plaat, spoel het tolueen met water en plaats de kwarts plaat in een groteglazen bakplaat in de zuurkast. Giet dan 100 ml van een 7:03 mengsel van 70% (v / v) salpeterzuur: 95% (v / v) ethanol en dekking van de kwarts plaat met een tweede glas lade. Let op: de reactie is zeer exotherm en soms explosieve draag passende bescherming en ervoor te zorgen dat de zuurkast schuifraam is ingesteld op de lagere 6 "niveau Was na het koelen van salpeterzuur met water en daarna 95% ethanol..
4) representatieve resultaten
1) cadaverine Standard Curve (figuur 3)
De test werd uitgevoerd zoals beschreven, maar zonder L-lysine of LdcI en in plaats verschillende concentraties van cadaverine werden gebruikt voor het empirisch bepalen van de lineaire bereik van de test. De test werd lineair tot een OD 340 van 0,25, wat overeenkomt met ~ 22 nmol van cadaverine (figuur 3).
2) Activiteit van LdcI (figuur 4)
De activiteit van LdcI alleen werd bepaald op 153,5 (± 18,1) nmol cadaverine min-1 ug LdcI-1 bij pH 6,5. De activiteit van LdcI wordt niet beïnvloed in aanwezigheid van 100 uM GTP of het BBP, maar is sterk geremd (> 10-voudig) in de aanwezigheid van pppGpp en ppGpp (figuur 4).
Figuur 1. Schematische weergave van de LdcI reactie. De decarboxylatie reactie van L-lysine om de CO 2 en cadaverine genereren is evenals de daarop volgende reactie met TNBS bij hoge pH-waarde aangetoond dat N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) en N, N te genereren '-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine). Op basis van Phan et al.11
Figuur 2. Instellen van Eppendorf thermostaat. De lay-out van de monsters in de 24-well Eppendorf thermostaat is afgebeeld, samen met beschrijving van de stappen van de test (vetgedrukt). Pijlen geven de overdracht van de reactie-oplossingen volgens het protocol. Het verwijderen van de reactie-oplossing naar de halte oplossing in de 96-wells plaat wordt ook aangegeven.
Figuur 3. Cadaverine Standard Curve. Een perceel van absorptie bij 340 nm versus nmol van cadaverine wordt weergegeven. Fout balken geven de standaardafwijking van ten minste drie onafhankelijke metingen. De lijn van de beste pasvorm is ook te zien en heeft een R2 van 0.996.
Figuur 4. LdcI testresultaten. Een perceel van de snelheid van LdcI activiteit (in nmol cadaverine geproduceerd min-1 ug-1 LdcI) is weergegeven in de aanwezigheid van 100 uM GTP, BBP, pppGpp, ppGpp en in de afwezigheid van nucleotide. De strenge reactie nucleotiden (p) ppGpp in staat zijn om significant remmen LdcI activiteit. De fout balken geven de standaardafwijking van ten minste zes onafhankelijke metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de lysine decarboxylase-test, is TNBS reageerde met de primaire amines van L-lysine en cadaverine naar TNP-lysine en TNP-cadaverine adducten (figuur 1) te vormen. Door de aanwezigheid van het carbonzuur groep op TNP-lysine, dit adduct blijft oplosbaar in water, terwijl de TNP-cadaverine, ontbreekt het carbonzuur-groep, in staat is partitioneren in tolueen 11. Dit type test kan breder worden ingezet op andere soorten aminozuren waar het verlies van een carbonzuur groep optreedt tijdens de reactie. Dit gebeurt tijdens de decarboxylatie van L-ornithine door de induceerbare ornithinedecarboxylase SPEF aan de polyamine putrescine 7 en de decarboxylatie van L-arginine door de induceerbare arginine decarboxylase Adia vorm aan de polyamine agmatine vier te vormen.
De LdcI test hier beschreven biedt een relatief snelle methode voor de bepaling van de activiteit van het gezuiverde eiwit in vitro. De belangrijkste voordelen van deze test zijn:
i) Het gebruik van meerdere duplo's per experiment verbetert de precisie van elke meting;
ii) De test kan worden uitgevoerd over een breed scala van buffer omstandigheden (verschillende pH, zout, reductiemiddel, enz.) zonder wijziging van het protocol;
iii) De test kan worden aangepast voor het meten van de in vivo activiteit van LdcI door bepaling van de hoogte van cadaverine uitgescheiden tijdens de celgroei.
De belangrijkste beperkingen van deze test zijn:
i) De gevoeligheid van de experimenten worden beperkt door de lineaire bereik van absorptie van het TNP-adducten;
ii) De meervoudige processtappen verhoging van de omvang van de experimentele fouten;
iii) Niet alle aminozuren decarboxylasen vatbaar zijn voor dit type van protocol. Bijvoorbeeld, de decarboxylatie van L-glutaminezuur door de induceerbare glutaminezuur decarboxylasen Gada / GadB genereert γ-amino-boterzuur 2, van de TNBS-adduct van die oplosbaar zijn in water te wijten zijn aan de aanwezigheid van de side-chain carbonzuur groep.
De biochemische onderzoek van het zuur stress respons van E. coli is een opkomend gebied van onderzoek en zal ons toelaten om beter inzicht in de moleculaire basis van stress respons in E. coli en aanverwante γ-proteobacteriën dat vergelijkbare zure reactie op stress-systemen zoals Salmonella enterica serovar Typhimurium 12 en Vibrio cholera 13 hebben. De ontdekking dat LdcI activiteit wordt geremd door de strenge reactie regulator ppGpp heeft ons een voorheen onbekende inzicht in de regulatie van dit eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) voor het sturen van bacteriestammen, plasmiden, en de nodige protocollen. Wij danken dr. John Glover (Vakgroep Biochemie, Universiteit van Toronto) voor het gebruik van de SpecraMax plaat lezer. Groot-Brittannië is de ontvanger van een National Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Postdoctorale Scholarship, een Canadese Institutes of Health Research Strategic Training Program in de Structurele Biologie van membraaneiwitten Gekoppeld aan de ziekte, en een Universiteit van Toronto Open Fellowship. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Canadian Institutes of Health Research (MOP-67210) aan WAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemistry. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D. Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. Curtiss, R., Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington, D.C. 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
