Summary
Aktiviteten i den inducerbara lysin decarboxylase övervakas genom att reagera substratet L-lysin och produkten cadaverine med 2,4,6-trinitrobenzensulfonic syra och bildar addukter som har differentiell löslighet i toluen.
Abstract
Escherichia coli är en enterisk bakterie som kan växa över ett brett spektrum av pH-värden (pH 5 - 9) 1 och, otroligt, kan överleva extrema sura betonar inklusive passagen genom däggdjur magen där pH-värdet kan sjunka så lågt som pH 1 till 02 februari. För att möjliggöra ett så brett spektrum av surt pH-värde överlevnad, E. coli äger fyra olika inducerbara aminosyra decarboxylases att decarboxylate deras substrat aminosyror i en proton-beroende sätt och därmed höjer den interna pH. Den decarboxylases inkluderar glutaminsyra decarboxylases gada och GadB 3, arginin decarboxylase Adia 4, lysin decarboxylase LdcI 5, 6 och ornitindekarboxylas SPEF 7. Alla dessa enzymer använder Pyridoxal-5'-fosfatsyntasgen som en co-faktor 8 och fungerar tillsammans med inre membran substrat-produkt antiporters som tar bort dekarboxylering produkter till externt medium i utbyte mot nya substrat 2. I fallet LdcI är lysin-cadaverine antiporter kallas CadB. Nyligen har vi bestämt att X-ray kristall struktur LdcI till 2,0 A, och vi upptäckte en ny liten molekyl bunden till LdcI de stränga svar regulatorn guanosin 5'-difosfat, 3'-difosfat (ppGpp) 14. De stränga respons uppstår när exponentiellt växande celler erfarenhet näringsämne berövande eller någon av ett antal andra påfrestningar 9. Som ett resultat av celler producerar ppGpp vilket leder till en signalering kaskad kulminerar i övergången från exponentiell tillväxt till stationär fas tillväxt 10. Vi har visat att ppGpp är en specifik hämmare av LdcI 14. Här beskriver vi de lysin decarboxylase analysen ändras från analysen utvecklats av Phan et al. 11, som vi har använt för att bestämma aktiviteten hos LdcI och effekten av pppGpp / ppGpp på denna verksamhet. Den LdcI dekarboxylering reaktionen bort α-karboxi grupp av L-lysin och producerar koldioxid och polyamin cadaverine (1,5-diaminopentane) 5. L-lysin och cadaverine kan reagerade med 2,4,6-trinitrobenzensulfonic syra (TNBS) vid höga pH-värde för att generera N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) och N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysin), respektive 11. Den TNP-cadaverine kan separeras från TNP-lysin som det förra är lösliga i organiska lösningsmedel som toluen medan den senare är inte (se figur 1). Den linjära utbud av analysen har fastställts empiriskt med renade cadaverine.
Protocol
1) Reagenser och utrustning
- Först förbereda följande tre lösningar: 1 ml av lösning A, som består av 8 mm L-lysin, 100 mm natrium 2 - (N-Morpholino) ethanesulphonic syra (MES) pH 6,5, 0,2 mM nukleotid, där nukleotid antingen guanosin difosfat (BNP), guanosin trifosfat (GTP), guanosin 5'-difosfat, 3'-difosfat (ppGpp) eller guanosin 5'-trifosfat, 3'-difosfat (pppGpp), 0,1 mM Pyridoxal 5'-fosfat (PLP) och 1 mm β-merkaptoetanol / (β-ME). 1 ml av lösning B som består av 100 mm natrium MES pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mm β-ME och 50 nm LdcI. LdcI renades som beskrivs i Snider et al. 6 och Kanjee et al. 14.
1 ml lösning C, som är identisk med Lösning B men innehåller inte LdcI. - Bereda 100 ml av den helhetslösning som består av 1 M natriumkarbonat (10,6 g/100 ml) och alikvot 50 mikroliter i varje brunn på en 96-håls polystyren plattan med hjälp av en flerkanalig pipett. Tillsätt 30 mikroliter av vatten på plattan och sedan täcka. Observera att summan av den mängd vatten som tillsätts och mängden prov extraheras under enzymet reaktionen måste vara lika 50 mikroliter. I detta fall kommer 20 mikroliter enzym reaktion prov tas bort.
- Förbered 5 ml TNBS lösning vid 10 mm genom att späda 294 mikroliter av 5% (w / v) TNBS lager med 4706 mikroliter vatten, linda in i aluminiumfolie och förvara på is.
- Jämvikta en Eppendorf Termostat Plus vid 37 ° C. Termostaten Plus har 24 brunnar i 6 kolumner. Se figur 2 för schematisk. Etikett 1,5 ml Eppendorf-rör som anger identitet nukleotid som ska testas (en per kolumn): GTP (kolumn A), BNP (kolumn B), ppGpp (kolumn C), pppGpp (kolumn D), ingen nukleotid (kolumn E ), och protein prover (kolumn F).
- Rack flera lådor med 200 mikroliter tips så att varje alternativa raden utelämnas ger totalt fyra rader av tips. Detta är nödvändigt för användningen av flera kanaler pipett med termostaten Plus heatblock under enzymet analysen.
- Jämvikta Digital Heatblock (VWR) vid 42 ° C.
- Placera en 96-håls 2,0 mL polypropylen plattan på is för att kyla.
2) LdcI analys
- Alikvotera 50 mikroliter av lösning A med lämpliga nukleotid till 1,5 ml Eppendorf-rör i varje av de fem kolumner i Eppendorf termostaten.
- Tillsätt 330 mikroliter av lösning B till tre rör i kolumn F och tillsätt 330 mikroliter av lösning C (no-proteinet kontroll) till det slutliga röret i kolumn F.
- Jämvikta lösningar vid 37 ° C i fem minuter. Tips: efter 5 minuter, skär av locken på rören i mitten av värme-block för att hindra dem från att störa multikanalspipett som ska användas nästa.
- Med hjälp av en 5-50 mikroliter VWR flerkanals pipett 50 mikroliter från rören i kolumn F i vart och ett av rören i kolumnerna AE. Starta timern så snart det första röret är blandad.
- Vid 2, 4 och 6 minuter bort 20 mikroliter av provet med hjälp av flerkanals pipett och tillsätt till helhetslösning.
- OBS: prover i samlad lösning kan täckas i plastfolie och frysta vid -20 ° C för senare bearbetning. Plattorna ska tinas i rumstemperatur innan reaktion med TNBS.
3) TNBS Reaction och Färg utveckling
- Tillsätt 50 mikroliter av 10 mm TNBS lösning på helhetslösning med flerkanals pipett och sedan inkubera vid 42 ° C i 6 minuter. Lösningen blir en mörk gul / orange färg som TNBS reagerar med lysin och cadaverine.
- Efter 6 minuter, kyl plattan på is för att bromsa reaktionen.
- Ta bort 100 mikroliter av provet med en VWR 20-200 mikroliter flerkanals pipett och placera den i 2 ml djupa brunnar som kyls på is. Överföring is-hink till fumehood.
- Tillsätt 500 mikroliter toluen till varje brunn med en HandyStep (Brand) Upprepa pipett och 12,5 ml pipettspetsen (PLASTIBRAND).
- Torka bort överflödigt toluen med hjälp av en kimwipe och täcka plattan med remsor av förpackningar tejp. Se till att trycka ner ordentligt för att få en bra tätning. Täck 96-brunnar med platt lock och skaka kraftigt under 1 minut och 30 sekunder.
- Lämna lösningar för att reglera i 5 minuter. The TNP-cadaverine är nu i övre toluen fasen, medan TNP-lysin är vattenlösliga (se figur 1).
- Ta bort 200 mikroliter av toluen med 20-200 mikroliter flerkanals pipett i en 96-brunnar för läsning. Obs: Se till att kontrollera att varje prov tas bort är klar och inte har någon botten vattenfasen. Obs: använd barriär tips för att förhindra skador på flera kanaler pipett av toluen.
- Läs av absorptionen vid 340 nm i en SpectraMax 340 plattläsaren.
- För att rengöra kvartsplatta skölja ur toluen med vatten och placera kvartsplatta i en storglastallriken i dragskåp. Häll över 100 ml av en 7:03 blandning av 70% (v / v) salpetersyra: 95% (v / v) etanol och täcka kvartsplatta med ett andra glas bricka. Varning: reaktionen är mycket exoterm och ibland explosiva bär lämpligt skydd och att säkerställa att dragskåpet bågen är satt till den lägre 6 "nivå efter kylning, skölj salpetersyra med vatten och 95% etanol..
4) representativa resultat
1) Cadaverine standardkurva (Figur 3)
Analysen utfördes enligt beskrivningen men utan någon L-lysin eller LdcI och istället olika koncentrationer av cadaverine användes för att empiriskt bestämma den linjära skalan för analysen. Analysen var linjär med en OD 340 på 0,25, motsvarande ~ 22 nmoles av cadaverine (Figur 3).
2) Verksamhet av LdcI (Figur 4)
Aktiviteten av LdcI ensam bedömdes vara 153,5 (± 18,1) nmoles cadaverine min-1 mikrogram LdcI-1 vid pH 6,5. Aktiviteten hos LdcI påverkas i närvaro av 100 mikroM GTP eller BNP, men är starkt hämmas (> 10-faldig) i närvaro av pppGpp och ppGpp (Figur 4).
Figur 1. Schematisk beskrivning av LdcI reaktionen. Dekarboxylering reaktion av L-lysin för att generera CO 2 och cadaverine visas liksom den efterföljande reaktionen med TNBS vid höga pH för att generera N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) och N, N '-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysin). Baserat på Phan et al.11
Figur 2. Inställning av Eppendorf Termostat. Layouten på prov i 24-väl Eppendorf Termostat visas tillsammans med beskrivningen av stegen i analysen (anges i fet stil). Pilarna anger överföring av reaktionen lösningar enligt protokollet. Borttagning av reaktionen lösning på helhetslösning i 96-brunnar är också anges.
Figur 3. Cadaverine standardkurvan. En tomt av absorbans vid 340 nm gentemot nmoles av cadaverine visas. Felstaplar representerar standardavvikelsen för minst tre oberoende mätningar. Raden av bästa passform visas också och har ett R2 på 0,996.
Figur 4. LdcI analysresultat. En tomt på graden av LdcI aktivitet (i nmoles cadaverine producerade min-1 mikrogram-1 LdcI) visas i närvaro av 100 mikroM GTP, BNP, pppGpp, ppGpp och i avsaknad av nukleotid. De stränga svar nukleotider (p) ppGpp kan väsentligt hämma LdcI aktivitet. Felet stapel avser standardavvikelsen för minst sex oberoende mätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I lysin decarboxylase analysen är TNBS reagerade med det primära aminer av L-lysin och cadaverine att bilda TNP-lysin och TNP-cadaverine addukter (Figur 1). På grund av närvaron av karboxylsyra grupp på TNP-lysin förblir denna addukt lösliga i vatten medan TNP-cadaverine, saknar karboxylsyra grupp, kan uppdelning i toluen 11. Denna typ av analys kan utnyttjas mer allmänt om andra typer av aminosyror där förlusten av en karboxylsyra grupp sker under reaktionen. Detta sker under dekarboxylering av L-Ornithine av inducerbara ornitindekarboxylas SPEF att bilda polyamin Putrescine 7 och dekarboxylering av L-arginin som inducerbara arginin decarboxylase Adia att bilda polyamin agmatin 4.
Den LdcI analys som beskrivs här ger en relativt snabb metod för bestämning av aktiviteten hos renat protein in vitro. De stora fördelarna med denna analys är:
i) Användning av flera replikat per försök förbättrar precisionen i varje mätning;
ii) att analysen kan ske över ett brett spektrum av buffert förhållanden (olika pH, salt, reduktionsmedel etc.) utan ändringar av protokollet;
iii) Den analysen kan ändras för att mäta aktivitet in vivo LdcI genom att bestämma mängden cadaverine utsöndras under celltillväxt.
Den stora begränsningar av denna analys är:
i) känsligheten för experiment begränsas av den linjära skalan för absorbans TNP-addukter;
ii) flera processteg öka graden av experimentella fel;
iii) Inte alla aminosyra decarboxylases kan bli föremål för denna typ av protokoll. Till exempel dekarboxylering av L-glutaminsyra av inducerbara glutaminsyra decarboxylases gada / GadB genererar γ-amino-smörsyra 2, den TNBS-addukten av dessa kommer att lösliga i vatten på grund av närvaron av sidokedjan karboxylsyra gruppen.
De biokemiska utredningen av syra stress i E. coli är ett växande område för forskning och ger oss möjlighet att bättre förstå den molekylära grunden för stress i E. coli och relaterade γ-proteobacteria som har liknande syra system stress såsom Salmonella enterica serovar Typhimurium 12 och Vibrio kolera 13. Upptäckten att LdcI aktivitet hämmas av den stränga svar regulatorn ppGpp har försett oss med en tidigare okänd inblick i regleringen av detta protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) för att skicka oss bakteriestammar, plasmider och nödvändiga protokoll. Vi tackar Dr John Glover (Institutionen för biokemi, University of Toronto) för användning av SpecraMax plattläsaren. Storbritannien är mottagare av ett nationellt Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Utbildningsbidrag, en kanadensisk Institutes of Health Research Strategisk utbildningsprogram på Strukturbiologi av membranproteiner är kopplat till sjukdom, och en University of Toronto öppen gemenskap. Detta arbete stöddes av ett bidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research (MOP-67.210) till WAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemistry. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D. Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. Curtiss, R., Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington, D.C. 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
