用于心肌组织工程的生物来源可注射材料的制备

摘要

从脱细胞组织制备可注射基质凝胶并将其注射入大鼠心肌的方法 体内 如上所述。

摘要

本方案提供了用于心肌组织工程的可注射细胞外基质（ECM）凝胶的制备方法。简言之，脱细胞组织经冷冻干燥、研磨、酶消化后，调节至生理pH值。冷冻干燥可完全去除组织中的水分，得到干燥的ECM，随后可用小型研磨机将其研磨成细粉。研磨后，ECM粉末经胃蛋白酶消化形成可注射基质。调节pH至7.4后，该液态基质材料即可注射入心肌组织。既往表征实验结果表明，由脱细胞心包和心肌组织制备的基质凝胶可保留天然ECM成分，包括多种蛋白质、多肽和糖胺聚糖。鉴于该材料在组织工程中的应用，in vivo表征尤为重要；本文提供了一种在小型动物模型中向左心室（LV）游离壁进行心肌内注射的方法，以分析宿主对基质凝胶的反应。通过膈肌入路进入胸腔，并在心尖稍上方的左心室游离壁进行注射。注射前可通过生物素标记该生物来源的支架材料，随后使用辣根过氧化物酶偶联的中性亲和素对组织切片染色，并通过二氨基联苯胺（DAB）显色进行观察。注射区域的分析也可通过组织学和免疫组织化学染色完成。通过上述方法，既往研究证实心包和心肌基质凝胶可在注射区域形成纤维状多孔网络，并促进血管生成。

方案

1. 组织预处理制备

1. 在使用本方案之前，必须已完成所选组织的脱细胞处理。本示例中，采用去离子水（DI水）中的低渗和高渗冲洗结合十二烷基硫酸钠（SDS）对新鲜的猪和人的心包组织样本进行脱细胞处理。
2. 具体而言，首先将猪心包组织在去离子水中洗涤30分钟，然后在含1% SDS的磷酸盐缓冲液（PBS）中持续搅拌24小时，随后用去离子水冲洗5小时。对于人心包组织，首先在去离子水中冲洗30分钟，然后在含1% SDS的PBS中持续搅拌60–65小时，接着进行过夜的去离子水冲洗。将所有样本从最终溶液中取出后，在流动的去离子水中再次冲洗¹。
3. 为验证脱细胞效果，取一小块组织，用O.C.T.包埋剂新鲜冷冻，并在整个样本中每隔100 μm切取10 μm厚的组织切片，用于组织学分析，方法如先前报道^34-36。
4. 使用苏木精和伊红（H&E）染色法检测组织中细胞核的缺失情况。也可使用荧光染料Hoescht 33342（1.0 μg/mL）对DNA进行染色以验证H&E结果；简要步骤为：固定切片，复水并用水冲洗，染色10分钟，然后充分冲洗并在避光条件下保存。或者，可使用商品化试剂盒（如Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒），该试剂盒可用于定量样本中的总DNA含量。

2. 可注射细胞外基质的制备

讨论

该方法可用于制备源于生物材料的可注射支架，以用于心肌组织工程。尽管这些方法最初是为心肌基质凝胶的制备及in vivo测试而开发，并在此以心包基质凝胶为例进行展示，但本方案可适用于任何组织类型，前提是该组织能够被适当去细胞化。在应用这些方法之前，应完成去细胞化处理并加以验证，因为基质凝胶中残留的DNA可能引发不必要的免疫反应。去细胞化材料的方法有多种，该领域已有若干优秀的综述文献^{3, 4}。

制备基质凝胶时，必须确保样品完全冻干，因为任何残留的水分都会影响研磨。此外，为避免吸入细胞外基质（ECM）粉末，研磨时应始终佩戴口罩。最后需要注意的是，当基质凝胶用于体内（in vivo）研究时，应尽可能以无菌方式操作，以降低污染导致感染的风险。如果将本方案修改用于不同类型的组织，则需要优化某些参数。例如，可以调整ECM的浓度——某些组织需要较高浓度才能形成凝胶，而另一些组织可能在较低浓度下即可凝胶化。此外，若所用胃蛋白酶的活性强度有显著差异，则所需的消化时间和胃蛋白酶浓度也可能需要相应调整。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂：
胃蛋白酶	Sigma-Aldrich	p6887-1G	冻干粉
生物素	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
中性亲和素-HRP	Thomas Scientific	21130
设备：
Wiley小型研磨机	Thomas Scientific	3383L10
Labconco冻干机	Labconco Corp.	7670520
手术用品：
聚维酮碘	Purdue Products L.P.	67618-154-16
乳酸林格氏液	MWI Veterinary Supply	003966
KY润滑胶	MWI Veterinary Supply	28658
利多卡因，2%	MWI Veterinary Supply	17767
盐酸丁丙诺啡	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
人工泪液软膏	Fisher Scientific	NC9860843
三重抗生素软膏	Fisher Scientific	19082795
异氟烷	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
耳镜	MWI Veterinary Supply	008699
三通阀	MWI Veterinary Supply	006245
3-0 Vicril缝线	MWI Veterinary Supply	J327H
5-0 Proline缝线	MWI Veterinary Supply	s-1173
反向切割（RC）针	Ethicon Inc.	8684G
微型止血钳	Fine Science Tools	13013-14
鼠齿微型镊	Fine Science Tools	11084-07
10号手术刀	Fine Science Tools	10110-01
钝头剪刀	Fine Science Tools	14108-09
锐利弯头剪刀	Fine Science Tools	14085-08
大型锯齿镊	Fine Science Tools	1106-12
PE160吸引管	BD Biosciences	427430
电动剪毛器	MWI Veterinary Supply	21608
皮肤缝合钉/缝合器	Ethicon Inc.	PRR35
通用耗材：
磁力搅拌器
0.1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70%乙醇
0.1 mL注射器
10 mL注射器
棉签
手术粘合剂
手术单
巾钳
小型手持式真空泵