Грамицидин основе флуоресценции Пробирной; для определения малых молекул Потенциал Изменение свойств липидного бислоя
Summary
Введем быстрой флуоресценции основе анализа, который контролирует скорость тушения флуоресценции в качестве меры активности канала грамицидина. Грамицидин каналы используются как молекулярные датчики силы, чтобы следить за изменениями в липидных свойства бислоя как воспринимается бислоя охватывающих белков.
Abstract
Многие лекарства и другие небольшие молекулы, используемые для модуляции биологические функции амфифилов которые адсорбируются на двухслойных / решения интерфейсом и тем самым изменять свойства липидного бислоя. Это важно, потому мембранных белков являются энергетически связаны с принимающей бислоя путем гидрофобных взаимодействий. Изменения в двухслойных свойства таким образом изменить мембранный белок, функция, которая предоставляет косвенные пути для амфифилов модулировать функцию белка и возможный механизм "вне целевой" эффектов препарата. Ранее мы уже разработаны электрофизиологические тест для обнаружения изменений в липидных свойства бислоя с использованием линейных каналов грамицидина в качестве зондов 3,12. Грамицидин каналы мини-белков образована transbilayer димеризации двух непроводящих субъединиц. Они чувствительны к изменениям в их мембраны окружающей среды, что делает их мощным датчиков для мониторинга изменений в свойства липидного бислоя как воспринимается бислоя охватывающих белков. Теперь мы продемонстрируем флуоресценции тест для обнаружения изменений в двухслойных свойства, используя те же каналы в качестве зондов. Анализ основан на измерении времени ходе тушения флуоресценции от флуорофора загружены большие пузырьки однослойных из-за вступления утоления по каналам грамицидина. Мы используем флуоресценции индикатор / утоления пару 8-aminonaphthalene-1 ,3,6-trisulfonate (муравьи) / Tl +, которая была успешно использована в других анализах тушение флуоресценции 5,13. Tl + пронизывает липидный бислой медленно 8, но легко проходит через проведение грамицидина каналов 1,14. Метод является масштабируемым и подходит как для механистических исследований и высокопроизводительного скрининга малых молекул для двухслойных-возмущающих и потенциальных "вне целевой", эффекты. Мы считаем, что результаты использования этого метода находятся в хорошем согласии с предыдущими результатами электрофизиологических 12.
Protocol
Discussion
Мы показали, быстрой флуоресценции основе анализа для определения бислоя изменения потенциала препаратов и других мелких амфифилов. Соединения, которые изменяют свойства бислоя, скорее всего, изменит мембранный белок функции в косвенной, неспецифический образом, возможно, способств?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Майкла Дж. Бруно, Радда Русинова и Джон Т. мешок за многочисленные стимулирующие дискуссии. Финансовая поддержка со стороны NIH, R01GM021342 и ARRA дополнения R01GM021342-35S1, и Иосия Мэйси, младший Фонд OSA; Tri-я CMB программа НИ и Iris L. и Леверетта С. Вудворт научный медицинский стипендий и грантов NIH MSTP GM07739 для РК.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
| gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
| PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |
References
- Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. Ion transport through simple membranes. Renal Function. , (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. Gramicidin channels. Versatile tools. Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).
- Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential. Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).
- Bruggemann, E. P., Kayalar, C. Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).
- Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).
- Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange. Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).
- Gutknecht, J. Cadmium & thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).
- Ingólfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Curcumin is a modulator of bilayer material properties. Biochemistry. 46, 10384-10391 (2007).
- Keserü, G. M., Makara, G. M. The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).
- Leeson, P. D., Springthorpe, B. The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry. Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).
- Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).
- Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).
- Neher, E. Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion. Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).
- O’Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association. Science. 250, 1256-1259 (1990).
- Søgaard, R. GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity. Biochemistry. 45, 13118-13129 (2006).
- Waring, M. J. Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).
