In dit protocol tonen we de uitdrukking, oplosbaar, en zuivering van een recombinant uitgedrukt membraaneiwit, MexB, als een oplosbare proteïne detergent complex. MexB is een multidrug resistance membraan transporter uit de opportunistische bacteriële pathogeen Pseudomonas aeruginosa.
Multidrug resistentie (MDR), het vermogen van een kankercel of een ziekteverwekker bestand te zijn tegen een breed scala aan structureel en functioneel niets anti-kanker geneesmiddelen of antibiotica, is een actueel ernstig probleem in de volksgezondheid. Dit multidrug resistentie is grotendeels te wijten aan energie-afhankelijke drug efflux pompen. De pompen verdrijven anti-kanker medicijnen of antibiotica in de externe medium, het verlagen van de intracellulaire concentratie onder een toxische drempel. We bestuderen multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, een opportunistische bacteriële ziekteverwekker die infecties veroorzaakt bij patiënten met vele soorten blessures of ziekte, bijvoorbeeld brandwonden of cystic fibrose, en ook in immuno-gecompromitteerde kanker, dialyse en transplantatie patiënten. De belangrijkste MDR efflux pompen in P. aeruginosa zijn tripartiete complexen bestaan uit een binnenste membraan proton-drug antiporter (RND), een buitenste membraan kanaal (OMF), en een periplasmische linker eiwit (MFP) 1-8. De RND en de OMF eiwitten zijn transmembraan eiwitten. Transmembraan eiwitten te maken meer dan 30% van alle eiwitten en zijn 65% van de huidige drug targets. De hydrofobe transmembraan-domeinen maken de eiwitten onoplosbaar is in waterige buffer. Voordat een transmembraan eiwit kan worden gezuiverd, is het noodzakelijk te vinden buffer voorwaarden met een mild schoonmaakmiddel waarmee de op te lossen proteïne als een eiwit reinigingsmiddel complex (PDC) 9-11. In dit voorbeeld gebruiken we een RND eiwit, de P. aeruginosa MexB transmembraan vervoerder, om te demonstreren hoe een recombinante vorm van een transmembraan eiwit tot expressie, oplosbaar te maken met behulp van reinigingsmiddelen, en dan zuiveren het eiwit reinigingsmiddel complexen. Deze algemene methode kan worden toegepast op de expressie, zuivering, en het oplosbaar maken van vele andere recombinant uitgedrukt membraaneiwitten. Het eiwit reinigingsmiddel complexen kunnen later gebruikt worden voor biochemische of biofysische karakterisering waaronder X-ray kristalstructuur bepalen of verknoping studies.
In aanvulling op multidrug resistance, vele vitale cellulaire activiteiten, waaronder ion transport, cel-cel communicatie, blaasje transport, onderhoud van de cellulaire structuur, en de gastheer-pathogeen interacties, omvatten eiwitten die zijn ingebed in het celmembraan. Transmembraan eiwitten maken meer dan 30% van de bekende eiwitten en zijn de doelstellingen voor het merendeel van de geneesmiddelen in gebruik zijn. De ongeoorloofde vouwen of de activiteit van transmembraan eiwitten leiden tot belangrijke genetische…
The authors have nothing to disclose.
Dit project werd ondersteund door subsidies aan CJJ van de National Science Foundation en de Vereniging voor Biomolecular Sciences.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
15ml tubes | Corning | 430052 | ||
See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
Akta system | GE Healthcare | |||
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |