Expresión, la solubilización de detergente, y purificación de un transportador de membrana, la proteína de resistencia a múltiples fármacos MexB
Summary
En este protocolo se demuestra la expresión, solubilización y purificación de una proteína de membrana recombinante expresado, MexB, como un complejo de proteínas solubles en detergente. MexB es un transportador de membrana de resistencia a múltiples fármacos de la bacteria patógena oportunista Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Resistencia a múltiples fármacos (MDR), la capacidad de una célula cancerosa o patógenos resistentes a un amplio rango de vista estructural y funcionalmente relacionadas fármacos contra el cáncer o los antibióticos, es un problema actual grave en la salud pública. Esta resistencia a múltiples fármacos se debe principalmente a la energía que dependen de las bombas de eflujo de drogas. Las bombas de expulsión de fármacos contra el cáncer o los antibióticos en el medio externo, la reducción de su concentración intracelular por debajo de un umbral tóxico. Estamos estudiando la resistencia a múltiples en Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista bacteriana que causa infecciones en pacientes con muchos tipos de lesiones o enfermedad, por ejemplo, quemaduras o la fibrosis quística, y también en personas inmunodeprimidas cáncer, diálisis y trasplante de los pacientes. El principal flujo de salida de las bombas MDR en P. aeruginosa son complejos tripartito formado por una membrana interna de protones antiporter drogas (RND), un canal de membrana externa (OMF), y una proteína de enlazador periplasmic (MFP) 1-8. Las proteínas RND y OMF son proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana representan más del 30% de todas las proteínas y son un 65% de los objetivos actuales de drogas. Los dominios transmembrana hidrofóbica que las proteínas insolubles en tampón acuoso. Antes de que una proteína transmembrana puede ser purificado, es necesario encontrar las condiciones de tampón que contiene un detergente suave que permite que la proteína se solubiliza como un complejo de proteínas de detergente (PDC) 11.09. En este ejemplo, se utiliza una proteína RND, el P. MexB aeruginosa transportador transmembrana, para demostrar la manera de expresar una forma recombinante de una proteína transmembrana, que solubilizan el uso de detergentes, y luego purificar los complejos de proteínas de detergente. Este método general se puede aplicar a la expresión, purificación, y la disolución de muchas otras proteínas de membrana recombinantes expresadas. Los complejos de detergente proteína pueda ser utilizado posteriormente para la caracterización bioquímica y biofísica incluyendo rayos X de la determinación de la estructura cristalina o estudios de entrecruzamiento.
Protocol
Discussion
Además de la resistencia a múltiples fármacos, muchas de las actividades celulares vitales, incluyendo el transporte de iones, la comunicación celular, el transporte de vesículas, el mantenimiento de la estructura celular, y las interacciones huésped-patógeno, involucrar a las proteínas que se incrustan en la membrana celular. Proteínas transmembrana representan más del 30% de proteínas conocidas y son el objetivo de la mayoría de los fármacos actualmente en uso. El plegado inapropiada y la actividad de las…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado por becas de CJJ de la Fundación Nacional de Ciencias y la Sociedad de Ciencias Biomolecular.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
| 2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
| LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
| DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
| 15ml tubes | Corning | 430052 | ||
| See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
| Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
| Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
| Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
| Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
| Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
| Akta system | GE Healthcare | |||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
| RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
| T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
| French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |
References
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