Isolamento di cellule endoteliali valvolare
Summary
Forniamo un metodo per isolare e popolazioni coltura pura di cellule endoteliali valvola cardiaca (VEC). VEC può essere isolato da entrambi i lati della cuspide o depliant e subito dopo, alla base di cellule interstiziali (VIC) isolamento è semplice.
Abstract
Valvole cardiache è l'unico responsabile per il mantenimento del flusso unidirezionale del sangue attraverso il sistema cardiovascolare. Queste sottili, tessuti fibrosi sono sottoposti a notevoli sollecitazioni meccaniche come aprire e chiudere diversi miliardi di volte in un ciclo di vita. L'incredibile resistenza di questi tessuti è dovuta alla valvolare residente endoteliale (VEC) e le cellule interstiziali (VIC) che costantemente la riparazione e rimodellare in risposta a segnali meccanici locali e biologici. Solo di recente abbiamo cominciato a capire i comportamenti unica di queste cellule, per il quale nella sperimentazione in vitro ha svolto un ruolo chiave. Particolarmente impegnativo è l'isolamento e la coltura di VEC. Particolare cura deve essere utilizzato dal momento in cui il tessuto viene rimosso dal host tramite placcatura finale. Qui vi presentiamo i protocolli per l'isolamento diretto, isolamento laterale specifico, la cultura, e la verifica delle popolazioni pura VEC. Noi usiamo digestione enzimatica seguita da una tecnica delicata raschiatura tampone per staccare le cellule di superficie. Queste cellule vengono poi raccolti in un tubo e centrifugati in un pellet. Il pellet viene quindi risospeso e placcato in fiasche cultura pre-rivestito con collagene I matrice. Fenotipo VEC è confermata dal contatto inibito la crescita e l'espressione di marcatori endoteliali specifici come PECAM1 (CD31), fattore di von Willebrand (vWF), e l'espressione negativa di alfa-actina del muscolo liscio (α-SMA). Le caratteristiche funzionali di VEC sono associati con alti livelli di LDL acetilato. A differenza di cellule endoteliali vascolari, VEC hanno la capacità unica di trasformare in mesenchima, che normalmente si verifica durante la formazione embrionale valvola 1. Questo può verificarsi anche durante confluenti in modo significativo dopo prolungata coltura in vitro, per cui la cura dovrebbe essere fatto per il passaggio o in prossimità confluenza. Dopo l'isolamento VEC, popolazioni pure di VIC può quindi essere facilmente acquisita.
Protocol
Discussion
La comprensione della biologia valvolare è stata compromessa da difficoltà tecniche di isolamento e la coltura popolazioni di puro valvolare cellule endoteliali. Tecniche di isolamento tipico coinvolgere digestione enzimatica della matrice sottostante basale o chimica di dissociazione dei legami adesivi endoteliale 2,3. Isolamento esperimenti preliminari sono stati valutati qualitativamente variando agenti dissociazione e periodi di incubazione. I risultati di questi esperimenti hanno dimostrato che l'E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è sostenuta dal riconoscimento alla CARRIERA NSF, la Fondazione Hartwell, e l'American Heart Association (# 0830384N).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
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