Выделение клапанные эндотелиальных клеток
Summary
Мы предлагаем метод выделения и культивирования чистых популяций клапанов сердца эндотелиальных клеток (VEC). VEC может быть изолирован от обеих сторон пороге или листовку и сразу после, лежащие в основе интерстициальная клетка (ВМЦ) изоляции прост.
Abstract
Сердце клапаны полную ответственность за сохранение однонаправленный поток крови через сердечно-сосудистой системы. Эти тонкие, волокнистые ткани подвергаются значительным механическим нагрузкам, как они открываются и закрываются в несколько миллиардов раз срок службы. Невероятная выносливость этих тканей происходит из-за резидентом клапанной эндотелия (VEC) и интерстициальные клетки (ВМЦ), которые постоянно ремонта и реконструируют в ответ на местные механические и биологические сигналы. Только недавно мы начали понимать уникальное поведение этих клеток, для которых в лабораторных экспериментов сыграло ключевую роль. Особенно сложным является изоляция и культуры VEC. Особое внимание должно быть использовано с момента ткань удаляется от хоста через окончательного покрытия. Здесь мы представляем протоколы для прямого изоляции, боковые конкретных изоляции, культуры, и проверка чистых популяций VEC. Мы используем ферментативного пищеварения следуют нежный технику соскабливания тампон, чтобы выбить только клетки поверхности. Эти клетки затем собирают в трубку и центрифугировали в гранулах. Осадок затем ресуспендировали и высевают в культуру колбы предварительно покрытых с коллагеном I матрицы. VEC фенотип подтверждается контакт ингибирует рост и экспрессию эндотелиальных специфических маркеров, таких как PECAM1 (CD31), фактор фон Виллебранда (фВ), и негативные выражения альфа-актин гладких мышц (α-SMA). Функциональные характеристики VEC связаны с высоким уровнем ЛПНП ацетилированного. В отличие от сосудистых эндотелиальных клеток, VEC имеют уникальную способность трансформироваться в мезенхимы, которое обычно происходит во время эмбрионального формирование клапана 1. Это также может произойти во время значительно увеличивал сливной должность в пробирке культуру, поэтому следует позаботиться должны быть направлены на прохождение в или около слияния. После выделения VEC, чистых популяций VIC могут быть легко приобретены.
Protocol
Discussion
Понимание клапанной биологии была нарушена технические трудности выделения и культивирования чистых популяций клапанной эндотелиальных клеток. Типичные методы изоляции включают ферментативного переваривания основных базальных матрицы или химической диссоциации эндотелиальных о…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование проводится при поддержке NSF КАРЬЕРА награду, Хартвелл Фонда и Американской ассоциации сердца (# 0830384N).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N. Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro. Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).
- Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin. J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).
- Cheunyg, W. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).
- Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).
- Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves. Circ Res. 96, 792-799 (2005).
- Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).
- Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2. Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Shi, Q. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 107, 1164-1169 (2003).
