הזרקת. עוברים stephensi ליצור מלריה עמידים יתושים

Summary

אנופלס יתושים stephensi הם וקטורים עבור מלריה בהודו המאכלסים וברחבי אסיה. וידאו זה מדגים את הטכניקה לביצוע microinjections של מין זה עם transgenes כי יעניק התנגדות מלריה אל היתוש. הרבה המתודולוגיה הפגינו וידאו זה הוא ישים טכניקות microinjection של מינים יתושים אחרים.

Abstract

המבוא של גנים חיצוניים לתוך הגנום של יתושים דורש טכניקות microinjection המותאמים למין ספציפי של עניין. זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה המשמשת את המעבדה ג'יימס microinject בונה DNA לעוברי אנופלס stephensi עבור הדור של יתושים טרנספורמציה. טכניקות להכנת מחטים microinjection, איסוף והכנת עוברי וביצוע microinjection מומחשים.

Protocol

הכנה מראש של microinjection: להאכיל יתושים דם: להזרקה מיום שני עד יום רביעי נקבות להאכיל ביום שישי הקודם. כדי להזריק חמישי ושישי, נקבות להאכיל ביום שני של אותו שבוע. הכינו את המחטים קוורץ באמצ…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Injection Quartz needles		Sutter Instrument		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Quiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification