Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System
Summary
Whole Embryo Kultur Technik ermöglicht es uns, Kultur Maus und Ratte Embryonen<em> Ex vivo</em> Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stufen. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte ganze Embryo Kultur nach E12.5 mit dem Rotor-Typ Flasche Kultur-System.
Abstract
Whole Embryo Culture (WEC) Technik hat im Jahr 1950 ist schon von New und seine Kollegen entwickelt und angewendet für Entwicklungsbiologie 1. Obwohl die Entwicklung und das Wachstum von Säugetieren Embryonen hängt entscheidend von der Funktion der Plazenta sind, ermöglicht WEC Technik uns zur Kultur Maus und Ratte Embryonen ex vivo Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stadien während der embryonalen Tag (E) 6,5-E12.5 in der Maus oder E8.5-E14.5 in der Ratte 2, 3, 4. In WEC, können wir direkt Bereichen von Embryonen mit feinen Glaskapillaren gewünschte Ziel, weil Embryonen unter dem Mikroskop manipuliert werden kann. Daher ist Nagetier WEC sehr nützliche Technik, wenn wir auf dynamische Entwicklungsprozesse postimplanted Säugerembryonen studieren wollen. Up to date, haben verschiedene Typen von WEC-Systeme bereits 1 entwickelt. Unter denen ist die Rotor-Typ Flasche Kultursystem beliebtesten und eignet sich für langfristige Kultur der Embryonen midgestation, dh nach E9.5 und E11.5 in der Maus und Ratte, bzw. 1. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte WEC nach E12.5 mit einem verfeinerten Modell der ursprünglichen Rotator System, das von Neu-und Cockroft 5, 6 entwickelt wurde, und stellen verschiedene Anwendungen der WEC-Technik für ein Studium in Säugetier-Entwicklung Biologie.
Protocol
Discussion
Es gibt zwei kritische Schritte in Nagetier WEC für den Erfolg. Erstens sollte die Dissektion Verfahren genau nicht zu beschädigen Embryonen, vor allem die Blutgefäße. Zweitens sollte das Verfahren so schnell wie möglich sein, da Sauerstoff und Nährstoffen nicht mehr versorgt werden über die Plazenta nach der Isolierung aus der Gebärmutter. Dies ist entscheidend für ältere Embryonen. Im Fall der Ratte WEC nach E12.5, sollten wir seziert Embryonen in Kultur-Flaschen Transfer innerhalb von 30 Minuten.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Hajime Ichijo für Video-Aufzeichnung und hilfreiche Ratschläge für die Bearbeitung des Videos. Wir danken auch Drs.Yuji Tsunekawa und Kaichi Yoshizaki für Art-Assistent für Video-Aufzeichnung. Diese Arbeit wird durch KAKENHI am Young Scientist B und auf die vorrangigen Bereiche-Molecular Brain Science aus MEXT von Japan unterstützt. Wir erkennen die Unterstützung der Global COE Program "Basic und Translational Research Center for Global Brain Science" von MEXT Japans und der Core Research für Entwicklungskreis Science and Technology (CREST) aus der japanischen Science and Technology Corporation aus Japan Science and Technology Agency (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comment |
| Setting up WEC | ||||
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | – | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | Millipore | SLGS033SS | |
| Anesthesia and isolation of the uterus | ||||
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) |
Tool | Iwaki | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Schering-Plough Animal Health | – | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | – | – | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. |
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles Rivers Laboratories Japan | – | |
| Preparation of culture medium | ||||
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any company | – | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | Becton Dickinson | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles Rivers Laboratories Japan | – | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | Gibco | 15240 | |
| Dissection of embryos | ||||
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | – | – | Made by hand using Pasteur pipette. |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
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