Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie
Summary
In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.
Abstract
De regulering van cellulaire adhesie aan de extracellulaire matrix (ECM) is essentieel voor cel-migratie en ECM remodeling. Focale adhesies zijn macromoleculaire assemblages dat het koppelen van de contractiele F-actine cytoskelet aan de ECM. Deze verbinding zorgt voor de overdracht van intracellulaire mechanische krachten over het celmembraan aan de onderliggende substraat. Recent werk is gebleken dat de mechanische eigenschappen van de ECM regelen focal adhesion en F-actine morfologie evenals tal van fysiologische processen, zoals celdifferentiatie, divisie, proliferatie en migratie. Zo is het gebruik van celkweek substraten een steeds gangbare methode om nauwkeurig te regelen en te moduleren ECM mechanische eigenschappen.
Te kwantificeren tractie krachten op focale adhesies in een aanhanger cel, voldoen substraten gebruikt in combinatie met hoge-resolutie beeldvorming en computationele technieken in een methode genoemd trekkracht kracht microscopie (TFM). Deze techniek is gebaseerd op metingen van de lokale omvang en richting van substraat vervormingen veroorzaakt door cellulaire contractie. In combinatie met hoge-resolutie fluorescentie microscopie van fluorescent gelabelde eiwitten, is het mogelijk om correleren organisatie van het cytoskelet en remodeling met trekkrachten.
Hier presenteren we een gedetailleerde experimentele protocol voor de bereiding van twee-dimensionale, compliant matrices voor het doel van het creëren van een celkweek substraat met een goed gekarakteriseerde, afstembare mechanische stijfheid, die geschikt is voor het meten van cellulaire contractie. Deze protocollen zijn de fabricage van polyacrylamide hydrogels, coating van ECM eiwitten op dergelijke gels, plating cellen op gels, en hoge-resolutie confocale microscopie met behulp van een perfusie kamer. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen locatie en de omvang van de cellulaire krachten met behulp van genoemde TFM protocollen.
Protocol
Discussion
De procedure hier beschreven voor het opzetten van een trekkracht microscopie (TFM) experiment samen, met de implementatie van computationele tracking routines (Sabass et al.., 2008), maakt voor de kwantificering van cellulaire krachten met micron-schaal ruimtelijke resolutie. Voor het optimaliseren van de experimentele protocol, is het van cruciaal belang voor een zuivere en uniforme gel substraat vormen met uniforme coating van ECM ligand. We bespreken hieronder mogelijke valkuilen:
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken het lab van Ulrich Schwarz voor computational tracking software die gebruikt wordt in de kwantificering van cellulaire trekkrachten (Sabass et al.., 2008). Dit werk werd ondersteund door een Burroughs Wellcome Career Award en de NIH directeur Pioneer Award (DP10D00354) naar ML Gardel en medische Scientist National Research Service Award (5 T32 GM07281) naar SP Winter.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
| 40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
| 2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
| TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
| Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
| Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
| Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
References
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. e. w. m. a. n., Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. i. s. c. h. e. r. Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses. Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).
- Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).
- Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading. Biophys J. 89, 676-689 (2005).
- Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions. J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophys J. 94, 207-220 (2008).
- Yeung, T. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).
