Beredning av Klagomål Matriser för kvantifiering Cellular Sammandragning
Summary
I denna video visar vi de experimentella tekniker som används för att tillverka kompatibla, extracellulära matrix (ECM) substrat som lämpar sig för cellodling och som kan bli föremål för dragkraft mikroskopi och observera effekter av ECM stelhet på cellens beteende.
Abstract
Regleringen av cellulära vidhäftning till den extracellulära matrix (ECM) är avgörande för cell migration och ECM ombyggnad. Fokal sammanväxningar är makromolekylära församlingar att koppla kontraktila F-aktin cytoskelettet till ECM. Denna anslutning möjliggör överföring av intracellulära mekaniska krafter genom cellmembranet till underliggande substrat. Senaste arbete har visat att mekaniska egenskaper ECM reglerar fokus vidhäftning och F-aktin morfologi samt ett stort antal fysiologiska processer, inklusive celldifferentiering, division, spridning och migration. Således har användningen av substrat cellodling blivit en allt vanligare metod för att exakt kontrollera och modulera ECM mekaniska egenskaper.
För att kvantifiera dragkrafter i fokus sammanväxningar i en anhängare cell är kompatibla substrat används tillsammans med hög upplösning bildbehandling och beräkningsteknik i en sk metod dragkraft mikroskopi (TFM). Denna teknik bygger på mätningar av det lokala storlek och riktning av substrat deformationer orsakade av cellulära kontraktion. I kombination med hög upplösning fluorescensmikroskopi av fluorescerande taggade proteiner, är det möjligt att korrelera cytoskelettala organisation och ombyggnad med dragkrafter.
Här presenterar vi ett detaljerat försöksprotokoll för beredning av två-dimensionell, kompatibel matriser i syfte att skapa ett substrat cellkultur med en väldefinierad, avstämbara mekanisk styvhet, som är lämplig för att mäta cellulär kontraktion. Dessa protokoll omfattar tillverkning av polyakrylamid hydrogeler, ytbeläggning ECM proteiner på sådana geler, plätering celler geler, och högupplösta konfokalmikroskopi med en perfusion kammare. Dessutom ger vi ett representativt urval av data som visar lokalisering och omfattning av cellulära krafter med hjälp av ovan TFM protokoll.
Protocol
Discussion
Det förfarande som beskrivs här för konfigurering av en dragkraft mikroskopi (TFM) experiment, tillsammans med genomförandet av datoriserad spårning rutiner (Sabass et al., 2008), möjliggör kvantifiering av cellulära krafter med micron skala rumslig upplösning. För att optimera experimentella protokoll, är det viktigt att bilda en ren och enhetlig gel substrat med jämn beläggning av ECM-ligand. Vi diskuterar potentiella fallgropar nedan:
Icke-enhetlig Gel Surface eller tå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar labbet av Ulrich Schwarz för numerisk mjukvara som används i kvantifiering av cellulära dragkrafter (Sabass et al., 2008). Detta arbete stöddes av en Burroughs Wellcome Karriär Award och NIH direktörens Pioneer Award (DP10D00354) till ML Gardel och medicinsk forskare National Research Service Award (5 T32 GM07281) till SP Winter.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | ||
| 40% Acrylamide | BioRad | 161-0140 | ||
| 2% Bis-acrylamide | Fisher BioReagents | BP1404 | ||
| TEMED | Fisher BioReagents | BP 150-20 | ||
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | ||
| 40nm fluorescent micro-spheres | Invitrogen | F8789 | ||
| Sulfo-SANPAH | Pierce | 22589 | ||
| Confocal imaging chamber (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | ||
| Coverslip spinner | Home-built | NA | ||
| Ultraviolet lamp CL1000 | UVP | 95-0228-01 | ||
| Stainless steel rack | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | ||
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | ||
| Hydrazine hydrate | Sigma Aldrich | 225819 | ||
| Sodium meta-periodate | Thermo Scientific | 20504 | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Coverslips (#1.5) | Corning | 2940‐224 | ||
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16120 | ||
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | ||
| Acetic Acid | Acros Organics | 64-19-7 |
References
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. e. w. m. a. n., Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. i. s. c. h. e. r. Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses. Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).
- Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed. J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).
- Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading. Biophys J. 89, 676-689 (2005).
- Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions. J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).
- Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophys J. 94, 207-220 (2008).
- Yeung, T. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).
