Vorbereitung der Maus Pituitary Immunogen für die Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis

Summary

Autoimmune Hypophysitis kann in Mäusen durch Injektion ein Auszug aus Maus Hypophyse Proteine ​​reproduziert werden.

Abstract

Autoimmune Hypophysitis ist eine chronische Entzündung der Hypophyse verursacht oder begleitet von Autoimmunität ^1. Es ist traditionell eine seltene Erkrankung, aber die Berichterstattung hat sich in den letzten Jahren zugenommen. Hypophysitis in der Tat entwickelt sich nicht selten als "Nebenwirkung" bei Krebspatienten mit Antikörpern, die hemmenden Rezeptoren auf T-Lymphozyten, wie CTLA-4 ² und PD-1-Rezeptoren exprimiert Block behandelt. Autoimmune Hypophysitis kann experimentell durch die Injektion von Mäusen mit Hypophysen-Proteine ​​mit einem Adjuvans ³ gemischte induziert werden. In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, wie Proteine ​​aus Maus Hypophyse und wie man sie in eine geeignete Form für die Induktion autoimmune Hypophysitis in SJL Mäusen vorbereiten zu extrahieren.

Protocol

Experimentelles Protokoll

Der erste Schritt in diese experimentelle Protokoll ist eine große Anzahl von Maus-Hypophyse zu sammeln. Der zweite Schritt ist, um die Drüsen zu homogenisieren, um ein Protein Extrakt herzustellen. Der dritte Schritt besteht darin, diese Proteine ​​mit einer öligen Mischung zu emulgieren.

Schritt 1: Sammlung und Lagerung von Maus Hypophyse

Die Maus Hypophyse sitzt an der Basis des Schädels in einer Vertiefung des Keilbeins genannt der Sella turcica, seitlich durch den Trigeminus-Nerven und nach vorn durch das Chiasma umgeben. Die Drüse ist von einer größeren Vorderlappen und kleineren hinteren und mittleren Lappen zusammengesetzt, und wiegt im Durchschnitt 1,9 mg. Hypophyse sind von Mäusen mit gemischten Stämme, Geschlechter und Altersgruppen, dazu bestimmt, durch die Tierstation eingeschläfert werden gesammelt.

Zur Isolierung der Hypophyse wird die Maus getötet, die Haut über den Schädel seziert, und die Schädelknochen aufgeschnitten mit einer Schere. Das Gehirn wird angehoben, um die Hypophyse, die dann von den umgebenden Dura mater ist isoliert aussetzen, schöpfte aus dem Keilbein und in einem Plastikröhrchen auf Trockeneis.

In der Regel verwenden wir 300 Maus Hypophyse für ein Protein Vorbereitung, eine Zahl, die von einer Person in 9 Stunden gesammelt werden können.

Sobald die Sammlung abgeschlossen ist, wird das Rohr mit der Hypophyse bei -80 ° C bis bereit für den nächsten Schritt gespeichert.

Schritt 2. Extraktion von Maus Hypophyse Proteine

1. Fügen Sie die Homogenisierungspuffer um einen 15-ml-Falcon-Röhrchen (Katalog Nr. 352059) gehalten in einem Eisbad mit 250 ul Puffer für alle 100 Hypophyse gesammelt. Verwenden Sie einen Puffer der Ionenstärke, ähnlich dem, das physiologisch im Inneren des Zytoplasma der Zelle (0,2 M) und des physiologischen pH-Wert (7,4) ist. Wir verwenden Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (0,161 M, pH 7,4), ergänzt mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich, Katalog Nr. P8340-1 ml).
2. Fügen Sie die Hypophyse auf den Puffer kurz vor der Homogenisierung und legen Sie dann den Generator (5-mm Durchmesser) der Polytron-Homogenisator an der Unterseite des Falcon-Röhrchen. Homogenisieren bei maximaler Drehzahl für 30 Sekunden, sanft bewegten die Falcon-Röhrchen auf und ab, während man selbst in das Eisbad. Dann ruhen die Homogenat auf Eis für 1 min. Wiederholen Sie die Homogenisierung und Kühlung Schritte zwei weitere Male. Diese sanfte Homogenisierung brechen sollte der Zellen und Freisetzung cytosolische Proteine, ohne dass der Kerne.
3. Zum Entfernen Kerne, ungebrochen Gewebe und unlösliche Stoffe (z. B. Bindegewebe und denaturiertes Protein-Komplexe), Zentrifuge das Homogenat bei niedriger Geschwindigkeit (1000g) für 10 min bei 4 ° C.
4. Übertragen Sie den Überstand (jetzt Post-Nuclear Überstand, PNS), um eine neue Falcon-Röhrchen, wobei darauf zu verlassen, das Pellet ungestört, und speichern Sie die PNS auf Eis.
5. Das Pellet in das ursprüngliche Volumen des Homogenisierungspuffer (250 ul Puffer für jeweils 100 Hypophyse gesammelt), wie oben zu homogenisieren, zentrifugieren wie oben, und kombinieren Sie die zweite PNS mit dem ersten.
6. Aliquot der beiden gepoolten PNS Proben in Reaktionsgefäße und bei -80 ° C bis bereit für den nächsten Schritt. Dieses Protein Präparat kann bei -80 ° C gelagert werden, sondern allmählich verliert seine Wirksamkeit, so empfehlen wir es innerhalb von 6 Monaten der Vorbereitung nutzen. Verwenden Sie eine kleine Teilmenge der Protein-Ausbeute und Konzentration von der BCA-Assay (Pierce Katalog-Nr. 23225), und die Qualität der Proteine ​​mittels Gelelektrophorese zu bestimmen. In der Regel erhalten wir etwa 60 mg Protein von 300 Maus Hypophysen in 1,5 ml Homogenisierungspuffer, bei einer Konzentration um 40 mg / mL.

Schritt 3. Herstellung der Emulsion für die Immunisierung

1. Tauwetter schnell die gefrorenen Protein Aliquots für das Experiment benötigt und stellen Sie die Proteinkonzentration auf 20 mg / mL. Dieses Protein-Extrakt wird 1:1 mit komplettem Freund-Adjuvans (CFA, Sigma F-5881) mit 5 mg / ml Hitze abgetötet Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231141) emulgiert werden. Jede Maus wird 1 mg Hypophysenextrakt in 100 ul der Emulsion zu erhalten.
2. Das hier angegebene Beispiel ist für die Immunisierung von 10 Mäusen, in denen jeder Maus mit 100 ul der Emulsion mit 1 mg Hypophyse Proteine ​​injiziert werden. Lassen Sie zwei extra Mäuse für materielle Verluste während der Vorbereitung, so mit 12 mg des Hypophysen-Proteine. Aspire 600 ul der 20 mg / mL Hypophyse Proteinextrakt beschreiben oben mit einem 2,5 mL Hamilton gasdichte Spritze. Resuspendieren CFA durch Schütteln, und streben 600 ul des CFA in ein anderes 2,5 ml Hamilton-Spritze. Befestigen und sichern eine 22-Gauge-Mikro-Emulgieren Nadel auf die Spritze mit CFA gefüllt. Langsam schieben Sie den Kolben der Spritze CFA, so dass die Nadel mit CFA gefüllt ist, dann befestigen und sichern Sie das andere Endedie Nadel auf die Spritze mit Hypophysenextrakt gefüllt.
3. Drehen Sie dazu den Kolben der Spritze CFA für die Öl-Komponente in die wässrige Hypophysenextrakt, so dass nur eine kleine Menge gemischt wird, voranzutreiben. Dann drücken Sie den Kolben der Hypophysenextrakt Spritze in den CFA Spritze. Wiederholen Sie diesen Vorgang schrittweise Erhöhung der Menge an Material gemischt. Weiter, bis der gesamte Inhalt der beiden Spritzen gemischt werden. Sie erhalten eine weißliche und gleichmäßig verteilte Lösung, dass das Wasser-in-Öl-Emulsion darstellt.
4. Nachdem die Emulsion entsteht, wiederholen Sie die Hin-und Rückwärtsbewegung mindestens 500 Mal, damit die Emulsion gründlich gemischt. Nach dem letzten Mischzyklus, ist die 1:1-Wasser-in-Öl-Emulsion gebrauchsfertig und enthält eine Hypophysen-Protein-Konzentration von 10 mg / mL. Die Emulsion wird injiziert selben Tag subkutan in narkotisierten Mäusen SJL werden, wie in der Begleiter JoVE Artikel beschrieben.

Discussion

Trotz der Tatsache, dass der erste Patient mit Autoimmun-Hypophysitis in 1962 ⁴ wurde berichtet, bleiben die pathogenen Hypophyse Autoantigene identifiziert ⁵ sein. Tiermodelle können sehr nützlich sein, um diese Autoantigene zu identifizieren, Beihilfe zur Entdeckung von Biomarkern, die übersetzbar Patientenversorgung leisten. Dieser Artikel hat eine einfache Verfahrensweise zur Herstellung von Hypophysen-Proteine ​​in einer Form, die geeignet für Induktion autoimmune Hypophysitis bei Versuchstieren nachgewiesen ist.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15-ml Falcon tubes
homogenization buffer
phosphate buffered saline
protease inhibitor cocktail
Polytron homogenizer
BCA assay	Pierce, Thermo Scientific	23225
Complete Freund’s Adjuvant (CFA)	Sigma-Aldrich	F-5881
Mycobacterium tuberculosis	BD Biosciences	231141
2.5 mL Hamilton gastight syringe
22-gauge micro-emulsifying needle