Colonie de cellules de formage (CFC) Dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines
Summary
Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est un dosage in vitro dans les progéniteurs hématopoïétiques, qui forment des colonies dans un milieu semi-solide. Une combinaison de la morphologie des colonies, la morphologie cellulaire et la cytométrie de flux sont utilisés pour évaluer la capacité des progéniteurs à proliférer et se différencier ainsi les différentes lignées hématopoïétiques.
Abstract
Humaines hématopoïétiques cellules souches / progénitrices sont généralement obtenus à partir de la moelle osseuse, sang du cordon ou du sang périphérique et sont utilisées pour étudier l'hématopoïèse et la leucémogenèse. Ils ont la capacité de se différencier en lignées lymphoïdes et myéloïdes. Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est utilisé pour étudier la prolifération et la différenciation des progéniteurs tendance hématopoïétique par leur capacité à former des colonies dans un milieu semi-solide. Le nombre et la morphologie des colonies formées par un nombre fixe de cellules d'entrée fournir des informations préliminaires sur la capacité des progéniteurs de différencier et de proliférer. Les cellules peuvent être récoltées à partir des colonies individuelles ou de la plaque entière pour mieux évaluer leur nombre et les états de différenciation par cytométrie en flux et l'évaluation morphologique de Giemsa lames colorées. Ce test est utile pour évaluer la différenciation myéloïde mais pas lymphoïdes. Le myéloïde terme dans ce contexte est utilisé dans son sens large pour englober lignées granulocytaire, monocytaire, érythroïdes et mégacaryocytaires.
Nous avons utilisé ce test pour évaluer les effets des oncogènes sur la différenciation des primaires humaines dérivées de cellules CD34 + du sang périphérique. Pour cette fin sont les cellules transduites avec le contrôle de construire soit rétroviraux ou une construction exprimant l'oncogène d'intérêt, dans ce cas-NUP98 HOXA9. Nous employons un vecteur rétroviral couramment utilisés, MSCV-IRES-GFP, qui exprime un ARNm bicistronique qui produit le gène d'intérêt et un marqueur de la GFP. Les cellules sont pré-activés par de plus en plus la présence de cytokines pendant deux jours avant transduction rétrovirale. Après deux jours, les cellules GFP + sont isolés par tri cellulaire par fluorescence (FACS) et mélangé avec un milieu semi-solide contenant méthylcellulose complétées par des cytokines et incubés jusqu'au colonies apparaissent à la surface, généralement 14 jours. Le nombre et la morphologie des colonies sont documentés. Les cellules sont ensuite retirés des plaques, lavés, comptés, et soumis à la cytométrie en flux et l'examen morphologique. La cytométrie en flux avec des anticorps spécifiques à la surface cellulaire des marqueurs exprimés au cours de l'hématopoïèse fournit des informations sur la lignée et le stade de maturation. Des études morphologiques des cellules individuelles au microscope après coloration de Wright-Giemsa fournir des informations supplémentaires à l'égard de la lignée et la maturation. Comparaison des cellules transduites avec le vecteur contrôle vide à ceux transduites avec un oncogène révèle les effets de l'oncogène sur la différenciation hématopoïétique.
Protocol
Discussion
Le dosage de CFC a été largement utilisée pour déterminer la prolifération et la différenciation des modèles de progéniteurs hématopoïétiques et d'étudier les effets des oncogènes (4, 5). Il a l'avantage sur les cultures de liquide d'être un test clonal, telles que les colonies constituent la descendance d'un ancêtre unique et peut être retiré individuellement pour une analyse ultérieure. La limitation du dosage de CFC est qu'elle n'est pas adéquate pour la détection de progé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
| FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
| FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
| SCF | Peprotech | 300-07 | ||
| TPO | Peprotech | 300-18 | ||
| IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
| IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
| HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
| PBS | Life Technologies | 14200 | ||
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
| Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
| Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
| Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
| 30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
| Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
| Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
| TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
| 1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
| Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
| Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
| Microscope | Olympus | BX51 | ||
| Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
| Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
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- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
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- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
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