Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas
Summary
O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é um ensaio in vitro em que células progenitoras hematopoéticas formar colônias em meio semi-sólido. Uma combinação de morfologia da colônia, morfologia celular e citometria de fluxo são utilizados para avaliar a capacidade dos progenitores a proliferar e se diferenciar ao longo dos diferentes linhagens hematopoiéticas.
Abstract
Humano-tronco hematopoiéticas / progenitoras células são normalmente obtidas da medula óssea, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico e são usados para estudar a hematopoiese e leukemogenesis. Eles têm a capacidade de se diferenciar em linhagens linfóide e mielóide. O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é utilizado para estudar o padrão de proliferação e diferenciação de células progenitoras hematopoéticas por sua capacidade de formar colônias em meio semi-sólido. O número ea morfologia das colônias formadas por um número fixo de células de entrada fornecer informações preliminares sobre a capacidade dos progenitores para se diferenciar e proliferar. As células podem ser colhidas a partir de colônias individuais ou de toda a placa para melhor avaliar os seus números e os estados de diferenciação por citometria de fluxo e avaliação morfológica de Giemsa-manchada slides. Este ensaio é útil para avaliar a diferenciação mielóide, mas não linfóides. O mielóide termo neste contexto é usada em seu sentido mais amplo para abranger linhagens granulocítica, monocítica, eritróide e megacariocítica.
Temos utilizado neste ensaio para avaliar os efeitos de oncogenes na diferenciação de humanos primários células CD34 + derivadas do sangue periférico. Para este fim são as células transduzidas com qualquer construção de controle retroviral ou uma construção expressando o oncogene de interesse, neste caso NUP98-HOXA9. Nós empregamos um vetor retroviral comumente usados, MSCV-IRES-GFP, que expressa um mRNA bicistronic que produz o gene de interesse e um marcador GFP. Células são pré-ativado pelo crescimento na presença de citocinas por dois dias antes de transdução retroviral. Após mais dois dias, as células GFP + são isolados por fluorescência-activated cell sorting (FACS) e misturado com um meio de metilcelulose contendo semi-sólido suplementado com citocinas e incubados até colônias aparecem na superfície, geralmente 14 dias. O número e morfologia das colônias são documentados. Células são então removidas das placas, lavados, contados, e submetido a citometria de fluxo e análise morfológica. Citometria de fluxo com anticorpos específicos para os marcadores de superfície celular, expressas durante a hematopoiese fornece informações sobre a linhagem e maturação. Estudos morfológicos de células individuais sob um microscópio após Wright-Giemsa coloração fornecer informações adicionais em relação a linhagem e maturação. Comparação das células transduzidas com controle de vetores vazios aos transduzidas com um oncogene revela os efeitos do oncogene na diferenciação hematopoiética.
Protocol
Discussion
O ensaio de CFC tem sido amplamente utilizado para determinar a proliferação e os padrões de diferenciação de células progenitoras hematopoéticas e estudar os efeitos dos oncogenes (4, 5). Tem a vantagem sobre culturas líquidas de ser um ensaio clonal, de tal forma que as colônias representam a progênie de um único progenitor e podem ser removidos individualmente para análise posterior. A limitação do ensaio CFC é que ele não é adequado para a detecção de células progenitoras imaturas ou mais célula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
| FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
| FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
| SCF | Peprotech | 300-07 | ||
| TPO | Peprotech | 300-18 | ||
| IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
| IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
| HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
| PBS | Life Technologies | 14200 | ||
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
| Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
| Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
| Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
| 30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
| Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
| Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
| TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
| 1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
| Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
| Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
| Microscope | Olympus | BX51 | ||
| Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
| Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
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- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
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- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
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- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
