Kolonibildande Cell (CFC)-analys för mänskliga hematopoetiska celler
Summary
Den kolonibildande celler (CFC)-analysen är ett in vitro test där hematopoetiska stamceller bildar kolonier i ett halvfast medium. En kombination av koloni morfologi, cellmorfologin och flödescytometri används för att bedöma möjligheten för stamceller att föröka sig och skilja längs olika hematopoetiska linjerna.
Abstract
Mänskliga hematopoetisk stamcellstransplantation / progenitorceller erhålls vanligen från benmärg, navelsträngsblod eller perifert blod och används för att studera blodbildningen och leukemogenesis. De har förmåga att differentieras till lymfoida och myeloida linjerna. Den kolonibildande celler (CFC)-analysen används för att studera spridning och differentiering mönster av hematopoetiska stamceller genom sin förmåga att bilda kolonier i ett halvfast medium. Antalet och morfologi av kolonierna som bildas av ett fast antal indataceller ge preliminär information om förmåga stamceller att differentiera och föröka sig. Celler kan skördas från enskilda kolonier eller hela plattan för att ytterligare utvärdera deras antal och stater differentiering med hjälp av flödescytometri och morfologiska utvärdering av Giemsa-färgade diabilder. Denna analys är användbar för att bedöma myeloid men inte lymfoida differentiering. Termen myeloisk i detta sammanhang används i vid bemärkelse till att omfatta granulocytisk, monocytic, erytroida och megakaryocytic linjerna.
Vi har använt denna analys för att bedöma effekterna av onkogener på differentiering av primära humana CD34 + celler från perifert blod. För detta ändamål celler transduced med antingen kontroll retrovirus bygga eller en konstruktion som uttrycker onkogen av intresse, i detta fall NUP98-HOXA9. Vi använder ett vanligt retrovirus vektor, MSCV-IRES-GFP, som uttrycker en bicistronic mRNA som producerar genen av intresse och en GFP markör. Celler är föraktiverade genom att växa i närvaro av cytokiner i två dagar innan retrovirala transduktion. Efter ytterligare två dagar, är GFP + celler som isolerats med fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och blandas med en metylcellulosa innehåller halvfast mediet kompletteras med cytokiner och inkuberas tills kolonier förekommer på ytan, vanligtvis 14 dagar. Antalet och morfologi av kolonierna är dokumenterade. Cellerna avlägsnas sedan från plåtarna, tvättade, räknade, och utsätts för flödescytometri och morfologiska undersökning. Flödescytometri med antikroppar som är specifika för markörer cellytan uttryck under blodbildningen ger information om härstamning och mognad skede. Morfologiska studier av enskilda celler i mikroskop efter Wright-Giemsa färgning ger ytterligare information om härstamning och mognad. Jämförelse av celler transduced med styrning tomma vektorn till dem transduced med en onkogen visar effekterna av onkogen på hematopoetiska differentiering.
Protocol
Discussion
CFC-analys har använts i stor utsträckning för att fastställa spridningen och mönster differentiering av hematopoetisk stamceller och att studera effekterna av onkogener (4, 5). Det har den fördelen framför flytande kulturer av att vara en klonal analys, så att kolonierna representerar avkomman av en enda stamceller och kan individuellt bort för vidare analys. Begränsningen av CFC-analysen är att det inte är tillräcklig för att upptäcka mer omogna stamceller eller hematopoetisk stamceller, sådana celler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
| FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
| FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
| SCF | Peprotech | 300-07 | ||
| TPO | Peprotech | 300-18 | ||
| IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
| IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
| HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
| PBS | Life Technologies | 14200 | ||
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
| Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
| Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
| Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
| 30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
| Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
| Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
| TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
| 1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
| Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
| Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
| Microscope | Olympus | BX51 | ||
| Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
| Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
- Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
- Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
