Colony Forming Cell (CFC)-Assay für humanen hämatopoetischen Zellen
Summary
Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay ist ein in vitro Assay, bei dem hämatopoetischen Vorläuferzellen bilden Kolonien in einem halbfesten Medium. Eine Kombination aus Koloniemorphologie, Zellmorphologie und Durchflusszytometrie werden verwendet, um die Fähigkeit der Vorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung entlang der verschiedenen hämatopoetischen Linien zu beurteilen.
Abstract
Humanen hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen sind in der Regel aus Knochenmark, Nabelschnurblut oder dem peripheren Blut gewonnen und genutzt werden, um die Blutbildung und Leukämogenese studieren. Sie haben die Fähigkeit, sich in lymphoiden und myeloischen Linien zu differenzieren. Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay wird verwendet, um die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen Muster durch ihre Fähigkeit, Kolonien in einem halbfesten Medium Form zu studieren. Die Anzahl und die Morphologie der Kolonien, die durch eine feste Anzahl von Input-Zellen gebildet vorläufige Angaben über die Fähigkeit der Vorläuferzellen zu differenzieren und zu vermehren. Die Zellen können aus einzelnen Kolonien oder die ganze Platte geerntet werden, um weiter zu prüfen ihre Zahl und Differenzierung Staaten mittels Durchflusszytometrie und morphologische Beurteilung der Giemsa-gefärbten Objektträgern. Dieser Test ist nützlich für die Beurteilung der myeloischen aber nicht lymphoide Differenzierung. Der Begriff myeloischer in diesem Zusammenhang ist im weiteren Sinne verwendet, um granulozytäre, Monozyten, erythroiden und Megakaryozyten Linien umfassen.
Wir haben diesen Test verwendet werden, um die Auswirkungen der Onkogene auf die Differenzierung von primären humanen CD34 +-Zellen aus dem peripheren Blut gewonnen zu beurteilen. Zu diesem Zweck Zellen sind entweder mit Kontrolle retroviralen Konstrukt oder ein Konstrukt Expression des Onkogens von Interesse transduziert, in diesem Fall NUP98-HOXA9. Wir beschäftigen eine häufig verwendete retrovirale Vektor, MSCV-IRES-GFP, dass eine bicistronische mRNA, die das Gen von Interesse und ein GFP-Marker produziert ausdrückt. Die Zellen werden durch die in Gegenwart von Zytokinen für zwei Tage vor der retroviralen Transduktion voraktiviert. Nach zwei weiteren Tagen werden GFP +-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert und mit einer Methylcellulose-haltigen halbfesten Medium mit Zytokinen ergänzt und inkubiert, bis Kolonien auf der Oberfläche, in der Regel 14 Tage angezeigt werden. Die Anzahl und Morphologie der Kolonien sind dokumentiert. Die Zellen werden dann von den Platten entfernt, gewaschen, gezählt und einer Durchflusszytometrie und morphologische Untersuchung. Durchflusszytometrie mit spezifischen Antikörpern an die Zelloberfläche Marker während der Hämatopoese ausgedrückt gibt Auskunft über Herkunft und Reifung der Bühne. Morphologische Untersuchungen von einzelnen Zellen unter dem Mikroskop nach Wright-Giemsa-Färbung liefern weitere Informationen in Bezug auf Herkunft und Reifung. Vergleich von Zellen transduziert mit Kontrolle leeren Vektor zu den transduzierten mit einem Onkogen zeigt die Auswirkungen des Onkogens auf hämatopoetischen Differenzierung.
Protocol
Discussion
Der CFC-Assay wurde intensiv auf die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen Muster zu ermitteln und die Auswirkungen der Onkogene (4, 5) Studie verwendet. Es hat den Vorteil gegenüber flüssigen Kulturen zu einer klonalen Assay, so dass die Kolonien die Nachkommen eines einzigen Stammvater vertreten und können individuell für die weitere Analyse entfernt werden. Die Begrenzung der FCKW-Test ist, dass es nicht für den Nachweis von mehr unreife Vorläuferzellen oder hämatopoetische S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
| FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
| FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
| SCF | Peprotech | 300-07 | ||
| TPO | Peprotech | 300-18 | ||
| IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
| IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
| HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
| PBS | Life Technologies | 14200 | ||
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
| Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
| Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
| Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
| 30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
| Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
| Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
| TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
| 1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
| Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
| Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
| Microscope | Olympus | BX51 | ||
| Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
| Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
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- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
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