Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы
Summary
Мы продемонстрируем, настройки и анализа предварительного микроРНК 96-луночного массивы для КПЦР использованием роботов, а также вручную с помощью пипетки Thermo Scientific многоканальный Matrix.
Abstract
Количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) стал точным и ценным инструментом в профилирования уровни экспрессии генов. Один из его многочисленных достоинств является нижний предел обнаружения по сравнению с другими методами генной профилирования выражения при использовании меньшего количества входа для каждого теста. Автоматизированные установки КПЦР улучшилась этой области, позволяя большей воспроизводимости. Его удобно и быстро и эффективно настроить обеспечивает высокую пропускную способность эксперименты, позволяя профилирования из многих различных генов одновременно в каждом эксперименте. Этот метод наряду с внутреннего контроля пластины также снижает экспериментальных переменных, общих для других методов. Недавно мы разработали КПЦР тест для профилирования предварительно микроРНК (предварительно микроРНК), используя набор из 186 пар праймеров. Микро РНК появились как новый класс малых, некодирующих РНК с возможностью регулировать многие цели мРНК на пост-уровне транскрипции. Эти небольшие РНК транскрибируется первой РНК-полимеразой II в качестве основного микроРНК (PRI-микроРНК) транскрипт, который затем расщепляется на предшественников микроРНК (предварительно микроРНК). Предварительно микроРНК экспортируется в цитоплазму, где Dicer расщепляет петли шпильки для получения зрелых микроРНК. Повышение уровней микроРНК можно наблюдать как на предшественников и зрелых уровни микроРНК и профилирование обе эти формы могут быть полезны. Есть несколько коммерчески доступных тестов для зрелых микроРНК, однако их высокая стоимость может отпугнуть исследователей из этого профилирования технику. Здесь мы рассмотрим экономически эффективных, надежных, SYBR основе КПЦР метод профилирования предварительно микроРНК. Изменения в предварительно микроРНК уровней часто отражают изменения зрелых миРНК и может быть полезным индикатором зрелого выражения микроРНК. Тем не менее, одновременное профилирование как до, так и зрелые микроРНК микроРНК может быть оптимальным, так как они могут способствовать неизбыточной информации и обеспечить понимание микроРНК обработки. Кроме того, техника, описанная здесь, может быть расширена, чтобы охватить профилирования других наборов библиотеки для конкретных путей или патогенов.
Protocol
Discussion
КПЦР является высокочувствительным анализа, который может быть использован для сравнения уровней экспрессии генов между образцами в исследовании, а также для определения положительности в случае вирусов. Преимущество использования КПЦР массивов возможность запуска многих праймеро…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH DE018304, R01DE018281. KT поддерживается T32 GM07092-34 и грантом в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл из Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) через Med в Град инициативы. ПК поддерживает T32 CA009156.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan | 30017587 | ||
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Scientific | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) | |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Scientific | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) | |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche | 04 707 516 001 | ||
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche | 05015243001 | 384-well version | |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 04729749001 | ||
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | ||
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche | 05075122001 | ||
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips – Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O’hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
