Summary
Оптические перерезки нерва широко используется модель взрослого травмы ЦНС. Девяносто процентов ганглиозных клеток сетчатки (РГК), чьи аксоны полностью перерезана (axotomy) умирают в течение 14 дней после axotomy. Эта модель легко поддается манипуляции и экспериментальных высокой воспроизводимостью.
Abstract
Ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в ЦНС нейроны, которые выводят визуальную информацию от сетчатки в мозг через зрительный нерв. Зрительного нерва могут быть доступны в орбите глаза и полностью перерезана (axotomized), резки аксоны весь РГК населения. Оптические перерезки нерва воспроизводимые модели апоптоза нейронов гибель клеток во взрослом ЦНС 1-4. Эта модель особенно привлекательна тем, стекловидное камеры глаза действует как капсулы для доставки лекарств к сетчатке, что позволяет с помощью экспериментальных манипуляций внутриглазных инъекций. Диффузии химических веществ через стекловидное жидкости гарантирует, что они действуют на весь РГК населения. Более того, РГК могут быть выборочно трансфекции, применяя короткий вмешательства РНК (siRNAs), плазмиды или вирусные векторы, чтобы сократить конце зрительного нерва 5-7 или инъекционные векторы в свою цель, верхний бугорок 8. Это позволяет исследователям изучать механизмы апоптоза в нужном нейронов населения, не смешивая воздействия на другие нейроны свидетеля или окружающей глии. Дополнительным преимуществом является легкость и точность, с которой выживаемость клеток может быть определена количественно после травмы. Сетчатка представляет собой плоскую, слоистых тканей и РГК локализованы в самый внутренний слой, слой ганглиозных клеток. Выживание РГК могут быть отслежены с течением времени, применяя флуоресцентные трассирующими (3% Fluorogold), чтобы сократить конце зрительного нерва во время axotomy, или путем введения трассирующими в верхний бугорок (РГК цель) за неделю до axotomy. Трассировщик ретроградно транспортируются, маркировка всей РГК населения. Потому что слой ганглиозных ячейка монослоя (одну ячейку толщиной), РГК плотности может быть определена количественно в квартире монтаж ткани, без необходимости стереологии. Оптические перерезки нерва приводит к апоптозу, 90% раненых РГК в течение 14 дней postaxotomy 9-11. RGC апоптоз имеет характерное время курс которой гибель клеток задерживается 3-4 postaxotomy дней, после чего клетки быстро вырождается. Это обеспечивает временное окно для экспериментальной манипуляции направлены против путей, участвующих в апоптозе.
Protocol
1. Хирургическая техника
- Эксперименты должны проводиться с использованием асептических условиях и после использования животных протоколов вашего конкретного учреждения. Инструменты и материалы (растворы, испытание веществ, трейсеры, иглы и т.д.) вступления в контакт с живой ткани должны быть стерильными, чтобы предотвратить инфекцию и негативного воздействия на животных и потенциального негативного воздействия на исследование.
2. Анестезия
- Крысы будут наркозом использованием ветеринарных изофлуран системы испарителем. Использование медицинского кислорода класса со скоростью 0,8 л / мин для испарения изофлуран газа. Место животных в приложенном поле анестезии и набрать в изофлуран концентрации 4% до дыхание замедлилось, и животное степенный.
- Затем переключатель потока газа в привязанности противогаз для стереотаксической рамы и место животного в стереотаксического аппарата. Включите изофлуран концентрации до 2% и мониторинг анестезии. Большие животные (> 300), может потребоваться более высокая концентрация изофлуран. Анестезия должна контролироваться во время операции и изофлуран дозировка корректируется. Глубина и частота дыхания должна постоянно оцениваться и ног щепотку оценки (каждые 5 минут) за отсутствие глубокой боли должны быть выполнены.
- Как только операция завершится, выключите изофлуран и позволяют животному дышать кислородом в течение нескольких минут до снятия с стереотаксического устройства. Температура тела должна быть сохранена, покрывая животное с хирургической одеяло и / или с использованием регулируемых одеяло отопления во время операции.
3. Хирургический подход
- Влажная шерсть на верхней части головы на 70% этанола, чтобы сделать шерсть легче резать. Удалить из меха между глазами использованием клипер или острые ножницы. Чистый разрез площадь в три раза с чередующимися применения йода раствором моющего средства (Proviodine, Бетадин, и т.д.), а затем на 70% этанола. Поддерживать роговицы влажные всей операции с применением офтальмологического глазная мазь (Слезы Naturale ТЧ) для роговицы. Распространение мазь по поверхности роговицы, вручную открывать и закрывать веки.
- Использование № 11 лезвие, сделать надрез вдоль средней линии головы от примерно 0,5 см от глаз до 1 см позади глаз. Уберите лоскут кожи над глазом использованием щипцов и аккуратно дразнить от подлежащей соединительной ткани с задней скальпеля. Затем убрать лоскут кожи в стороны и вниз и удерживать на месте с помощью хирургического втягивающим, которые могут быть прикреплены к базе стереотаксического прибора.
- Сделать разрез вдоль превосходные края орбитальной кости, а потянув за вышележащих фасции с острыми щипцами. Это позволит снять фасции покрывающей орбиты глаза. Обод орбитальной кости могут быть четко разграничены с помощью щипцов, чтобы надавить на фризе вышележащих орбиту. Использование прижигания устройства или скальпель, продолжают разрез назад к задней предел орбиты глаза. Используйте кость превосходный орбиту в качестве руководства для разреза. Следующая продолжают разрез вперед к переднему предел орбиту. Разрез верхнего орбиту лучше всего сделать с помощью небольшого устройства прижигания, чтобы предотвратить кровотечение из основных сосудов, которые общаются с венозных синусов.
- Если кровотечение происходит несколько шагов могут быть приняты. Во-первых, давление стерильные хирургические тампоны или ватные тампоны. Если кровотечение продолжается, применяют холод, стерильного физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) в области с помощью капельницы, и поддерживать давление. Небольшое кровотечение остановится после нескольких секунд с помощью этой процедуры. Если кровотечение продолжается, применяют тяги к ткани с хирургической тампоном или ватным тампоном, чтобы определить источник кровотечения и быстро прижечь под угрозу судна. После кровотечения содержится, использование холодного стерильного PBS для очистки хирургических области крови. Хирургических области должны быть периодически очищать таким образом, чтобы лучше визуализировать структуры в орбиту глаза.
- Как только разрез был очищен, используйте щипцы и задней скальпель для очистки соединительной ткани на задней стенке глаза, который перекрывает орбитальной содержание. Задней № 11 скальпель хорошо работает в качестве наконечника в порядке. Это откроет глубокие части орбитальной полости предоставления большего хирургических окно, чтобы работать дюйма Используйте Дюмон # 7b острыми изогнутыми-зубчатые щипцы при работе в глаза, как их кривизны и мелкие советы идеально подходят для манипулирования структурами в орбите. Кроме того, зубцы помочь с захватом структур.
- Затем удалите соединительную ткань, которая окружает офтальмологических разделения тройничного нерва, которая сидит возле средней линии, и удалить нерв использованием щипцов. Этот шаг не является необходимым, однако удаление нерва обеспечит большее окно доступомс до зрительного нерва позже.
- После удаления нерва, использование щипцов отказаться от кровеносных сосудов ниже, и полностью прижигать сосуд. Этот шаг также не является необходимым, однако прижигания судна позволяет ему быть перемещен вперед, создавая тем самым большие окна один раз зрительного нерва будет достигнута.
- Используйте острый пару щипцов или пинцета, которые имели свои советы загнуты внутрь тщательно выбрать и удалить тонкий слой соединительной ткани более наружных мышц и слезной железы. Уберите дополнительные глазные мышцы спереди назад по орбите. Возьмитесь за проксимальной части мышцы с парой щипцов и использовать вторую пару изогнутых щипцов глазом зубчатые соусом применять наружу тяги на мышцы. Убедитесь, что щипцы глаз повязка ориентированы в том же направлении, потянув мышцы, когда для того, чтобы предотвратить разрыв. Удалить самой передней мышцы орбиты (Superior косой) в этой манере. Мышцы будут освобождены от глубоко внутри орбиты и оставшиеся длина может быть втянута для того, чтобы повернуть глаза наружу.
- Повторите шаг 3,8 с очередным мышцы (медиальной Rectus), который расположен между лопастями слезной железы и Harderian железы возле средней линии дорсальной поверхности глаза. Лента вниз втягивающим устройством для поддержания тяги на мышцы.
- Аккуратно удалите оставшиеся соединительной ткани по поверхности слезной железы и поднимите вверх железы использованием щипцов. Не сжимать или сжать железы. Для того, чтобы отказаться железы, только одно судно у заднего полюса должна быть обезболивающий укол. Поднимите заднем конце железы вверх, а затем прижигать сосуд.
- Затем лоскут слезной железы вперед, чтобы открыть заднюю часть орбиты и беспрепятственную доставку мышцы, которые залегают зрительный нерв. Держите области постоянно влажной использованием стерильных PBS, и сушки с хирургическим тампоны или ватные тампоны.
- Использование резкого щипцы снова удалить тонкий соединительной ткани, которая окружает мышцы задней орбиты (Levator Palpebrae Superioris и Верхнее Rectus) и отдельные основные пучки мышцы. Уберите мышцы самостоятельно или в унисон, используя изогнутый пинцет глаз зубчатые соусом, еще раз, потянув в соответствии с мышечными волокнами. Прикрепите оставшиеся длины мышцы втягивающим вместе с мышцами, которые убирались в шагах 3.8 и 3.9 и лентой вниз втягивающим применять тягу. В общей сложности 4 мышцы теперь будет прикреплен к втягивающим. Это будет вращать глазами вперед и наружу с целью выявления жиросодержащих оболочка, которая окружает зрительный нерв.
4. Доступ зрительного нерва
- Используйте пинцет резкое (Fine наконечник Дюмон), чтобы тянуть вверх на соединительную ткань, которая окружает жировой оболочки зрительного нерва. Сделать продольный разрез с использованием малых весны Vannas ножницами. Развернуть сократить по мере необходимости. Жир, содержащийся в оболочке начнет выпирают раз надрез. Следующая удалить закрылки соединительной ткани, аккуратно потянув вверх от края и отсечения в форме полумесяца закрылки ткани.
- Удалить жир, покрывающий зрительного нерва с помощью щипцов, чтобы надеть жира, в то время резки ножницами Vannas весной. Держите в чистоте использованием стерильной PBS и хирургических мазки для очистки небольших количеств крови, которые возникают из-за удаления тканей.
- Зрительного нерва в настоящее время видны. Чтобы получить доступ к нерву, менингеальные оболочки, которая окружает нерв необходимо удалить, не повредив глазной артерии, которая питает внутренний сетчатки. Изучение сосудистого рисунка из менингеальные оболочки использованием щипцов, чтобы аккуратно повернуть ножны. Ищите области лишенной кровеносных сосудов, и разрешения продольного разреза должны быть внесены в менингеальные оболочки.
- Использование тонкой наконечником Дюмон щипцы, щепотка оболочки и потяните вверх. Рядом с базой треугольной формы клин твердой мозговой оболочки, которая создается, используйте ножницы Vannas весной, чтобы сделать небольшой разрез в ножны. Вставьте нижнюю лезвие ножниц в разрез и вырезать оболочкой параллельно направлению зрительного нерва, стараясь не повредить сосудистую с боковыми разрезами. Используйте щипцы и ножницы, чтобы драпировка оболочки по обе стороны от зрительного нерва.
- Единственный оставшийся покрытие нерв паутинной оболочки. Это очень тонкая и прозрачная. Для того, чтобы определить, мембраны по-прежнему присутствует, используйте острые щипцы ущипнуть поверхности нерва. Это паутинной присутствует, щепотка мембраны и тянуть вверх, чтобы создать треугольную клин ткани. Сделайте небольшой надрез кончиком ножниц похоже на шаг 4.4. Затем вставьте нижние лезвие ножниц и сделать продольный разрез в паутинной оболочки. Затем с помощью вашего ножницы и пинцет, чтобы драпировка паутинной по обе стороны от зрительного нерва.
- Использование микро-Сюркосмологической крюк, поднять зрительного нерва из менингеальные оболочки. Pass кончик крюка вокруг внешнего края нерва и убедиться, что крючок находится в контакте с нервом, чтобы вы не ловите менингеальные мембран с крючка и случайно разрезе их. Аккуратно поднимите зрительного нерва из менингеальные оболочки и полностью разреза нерва позади точки поддерживается крючок. Пересекаются оптические культи нерва теперь будут иметь свободный конец, обеспечивая удаление крючок.
- Если РГК будут ретроградно меченых для того, чтобы количественно выживание, место небольшой кусок gelfoam пропитанную 3% Fluorogold (или другой ретроградный индикатор) за перерезанного оптических культи нерва (см. Юпитер протокол 2261 ).
5. Закрытие и восстановление
- Уменьшить тягу на дополнительные глазные мышцы и вернуть глаза на нейтральное положение. Делая это, убедитесь, что толкать вниз gelfoam в орбиту глаза, чтобы, как глаз поворачивается обратно на место, gelfoam остается вокруг зрительного нерва пень. Вернуться слезной железы и дополнительные глазные мышцы, чтобы их естественное положение.
- Вернуться лоскут кожи к средней линии и шовные раны. Применение мази глазной глаза на обоих глазах. Затем выключите изофлуран источника и позволяет животному дышать кислородом в течение нескольких минут. Место животное в отапливаемом клетку или клетку под лампой тепло, чтобы оправиться. Не ставьте чайник восстановления клетку, чтобы устранить возможность аспирации постельные принадлежности во время восстановления.
- Животные должны быть размещены самостоятельно после операции. Сообщение хирургических анальгетики следует назначать в соответствии с указаниями вашего животного властей помощи, а животные должны быть тщательно проверены после операции.
6. Представитель Результаты:
Перерезка оптические результаты нерва в потере 90% раненых РГК в течение 14 дней postaxotomy 9-11. Основным механизмом РГК смерти 9 апоптоз, 12. Нормальной плотности РГК составляет около 2500 клеток / мм 2. Epifluorescence или конфокальной микроскопии могут быть использованы для визуализации ретроградно меченых РГК после axotomy. RGC апоптоз задерживается примерно на 4 дня после axotomy, оставив временное окно для экспериментальных манипуляций. На 1 день после axotomy и ретроградная маркировки с Fluorogold, RGC органов ячейки в слое ганглиозных клеток сетчатки и аксонов пучков в слое нервных волокон сетчатки четко видны, когда изображение flatmounted подготовки (рис. 1а). По состоянию на 14 дней после axotomy, большинство из РГК умерли, и немногие оставшиеся РГК перемежаются между сетчатки микроглии (рис. 1b). Когда РГК подвергаются апоптозу, микроглии фагоцитируют мертвые клетки, и в результате стать transcellularly помечены флуоресцентным трассирующими, который был использован для обозначения РГК 13, 14. Появление примеси в фагосом микроглии отличается от таковой у выживших РГК. Микроглии содержат примеси в высокой концентрации и очень ярких фагосом, которые являются относительно крупными и разбросаны по всей их цитоплазме (рис. 1в). РГК иметь более диффузной структуре окрашивания (рис. 1в) с небольшой точечной пузырьки, которые были ретроградно транспортируется вниз свои аксоны подачи цитоплазме клетки. Эти пузырьки гораздо меньше, и менее интенсивным флуоресценции позволяющих дифференцировать выживших РГК от микроглии. Кроме того, микроглии имеют намного меньше клеток и органов, как правило, звездчатые или амебоидных морфологии, в отличие от РГК, которые имеют относительно большие и округлые тела клетки. Дендритных деревьев РГК также может помочь отличить их от коротких ярких процессов микроглии, когда количественной выживаемость клеток. Выживаемость клеток может быть определена количественно в различных регионах сетчатки и плотности (клеток / мм 2), могут быть экстраполированы от площади соответствующего микрофотографии, так как РГК находятся в монослое в пределах слоя клеток ганглия.
Рисунок 1. Epifluorescence микрофотографии Fluorogold помечены РГК после axotomy и применение трассирующих зрительного нерва пень. () 1 день после РГК axotomy и их пучков аксонов помечены примеси в тонкой точечной манере. (B) К 14 дней после axotomy, 90% из РГК погибли и ярко помечены микроглии, которые фагоцитированы мертвых клеток, также помечены индикатора. (C) Высшее увеличение иллюстрирующий разницу между РГК и микроглии (красные стрелки) на 14 postaxotomy дней. Шкала бар в А и В составляет 50 мкм. Шкала бар в C составляет 25 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть много вариантов этой хирургической процедуры, и несколько из шагов в этом протоколе не нужны. Нужно только отказаться от мышц, которые залегают зрительный нерв для того, чтобы получить доступ к нерву. Тем не менее, это приводит к очень ограниченным рабочим пространством вокруг нервных принятия критических заключительных этапах перерезки более трудным. В некоторых случаях желательно для трансфекции клеток из оптического культи нерва и расширение доступа пространство предоставляемой втягивания все наружные мышцы и слезной железы выгодно в данном случае.
Наиболее важных шагов в протоколе шаги 4.3-4.6. Важно, чтобы не повредить сосудистую вокруг зрительного нерва. Нерва должна быть перерезана 1.5-2.0 мм от задней части глаза, чтобы избежать повреждения глазной артерии который проникает нерва в пределах одного миллиметра от глаз и питает кровь внутренней сетчатки. Таким образом, за счет поддержания небольших рабочих расстояние от задней стенки глаза повреждение глазной артерии можно избежать. Сетчатка, как правило, прозрачные и кровеносные сосуды могут быть четко разграничены. Если кровоснабжение сетчатки повреждена сетчатка выродится, ведущих к молочно-белый хлопьевидный внешний вид. Стекловидной камеры глаза и линзы, как правило, облака над, а также, с глаз сокращается в размере с течением времени.
С практикой, все шаги в полной хирургическая процедура может быть выполнена в течение 10-15 минут в глаз, после того как первоначальные сокращения вступления были сделаны. Процедура также может быть выполнена из боковых подход к орбиты и либо маршрут очень поддаются процедурной модификации на основе предпочтений исследователя. Эта модель имеет очень воспроизводимые время курс клеточной смерти и Есть несколько способов целевой сетчатки глобально или непосредственно целевой ранения РГК, чтобы проверить эффекты экспериментального лечения на выживаемость клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
PDK поддерживается операционной CIHR гранта (СС 86523)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic Frame | Stoelting Co. | ||
| Rat Gas Mask | Stoelting Co. | ||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | ||
| Proviodine | Medline Industries | MDS093945H | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Micro surgical hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Eye dressing serrated forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #7b sharp curved serrated forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 |
References
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
- Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
- Valenzuela, G. arcia, E, S. C. S. harma Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer. Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).
- Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
- Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125, 903-920 (2004).
- Berkelaar, M. Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).
- Villegas-Perez, M. P. Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci. 8, 265-280 (1988).
- Villegas-Perez, M. P. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
- Quigley, H. A. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).
- Thanos, S. Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration. Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).
- Thanos, S. Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells. Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).
