X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化
Summary
分子の3次元構造がどのように分子の機能のユニークな理解を提供します。ニア原子分解能で構造決定のための主要な方法は、X線結晶です。ここで、我々はX線結晶構造決定に適している任意の高分子の三次元結晶を得るための現在の方法を示しています。
Abstract
彼らがどのように機能するか推測する生体高分子の三次元構造を使用すると、現代生物学の最も重要な分野の一つである。原子分解能構造の可用性は、タンパク質の機能の深さとユニークな理解を提供し、そして生きている細胞の内部の仕組みを解明するのに役立ちます。これまでに、蛋白質構造データバンク（RCSB – PDB）のエントリの86％がX線結晶学を用いて決定された巨大分子の構造です。
結晶解析に適した結晶を得るために、高分子（例えばタンパク質、核酸、タンパク質 – タンパク質複合体やタンパク質 – 核酸複合体）が均一にまで精製する必要がある、またはできるだけ近い均一になるまで。準備の均一性は高解像度（;マクファーソン、1999 Bergfors、1999）に回折する結晶を得るための重要な要素です。
結晶は、過飽和に高分子をもたらす必要があります。サンプルは、したがって、高分子の凝集または沈澱（通常は20〜50 mg / mL）を起こすことなく可能な限り高い濃度に濃縮する必要があります。沈殿剤にサンプルを導入することは、溶液から成長する大型の三次元結晶をもたらすことができます溶液中でのタンパク質結晶の核形成を促進することができます。蒸気拡散とバッチの結晶化：結晶を取得する2つの主なテクニックがあります。蒸気拡散、沈殿剤と蛋白溶液の混合物を含むドロップで純粋な沈殿剤とチャンバー内に封入されている。ドロップと沈殿剤の浸透圧は（図1A）等しくなるまで水蒸気は、ドロップから拡散する。均衡が達成されるまで滴の脱水は、理想的に相図の結晶核のゾーンで、タンパク質と沈殿剤の両方の遅い濃度を引き起こします。バッチ法は、沈殿剤の適切な量（図1B）とを混合タンパク質によって核のゾーンに直接タンパク質をもたらすに依存しています。このメソッドは、通常ドロップのうち水の拡散を防ぐために、パラフィン/鉱物油の混合物の下に実行されます。
ここでは、石油のもとでのバッチ結晶化に加えて、ドロップやシッティングドロップを吊り下げ、蒸気の拡散のための実験装置の二種類のデモンストレーションを行います。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、タンパク質の結晶化のための一般的な現在のプロトコルを説明し、実証する。マルチステップの手順でそれ以来、いくつかの考慮事項は次のことに注意一つのニーズがあります。非常に少量（0.5-2μL）で作業する場合、蒸発による減少の乾燥は大きな懸念事項です。したがって、それは十分に制御された環境（低空気の流れと、高湿度と厳しい温度制御）で動作するように、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、YMにバロウズウェルカムの研究者賞で、エール大学からMDへのブラウン – コックスポストドクトラルフェローシップでサポートされていました。
Materials
| New Item | ||||
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
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