Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X
Summary
A estrutura 3-D de uma molécula fornece um entendimento único de como as funções molécula. O principal método para determinação da estrutura de quase-atômica resolução é cristalografia de raios X. Aqui, demonstramos os métodos atuais de obtenção de cristais tridimensionais de qualquer macromolécula, uma vez que são adequados para determinação de estrutura por cristalografia de raios X.
Abstract
Usando a estrutura tridimensional de macromoléculas biológicas para inferir como eles funcionam é uma das áreas mais importantes da biologia moderna. A disponibilidade de estruturas de resolução atômica fornece uma compreensão profunda e única da função da proteína, e ajuda a desvendar o funcionamento interno da célula viva. Até o momento, 86% do Protein Data Bank (PDB-RCSB) as entradas são estruturas macromoleculares que foram determinados através de cristalografia de raios X.
Para obter cristais adequados para estudos cristalográficos, a macromolécula (proteína, por exemplo, ácidos nucléicos, proteína-proteína-proteína complexa ou complexo de ácido nucléico) deve ser purificada à homogeneidade, ou o mais próximo possível à homogeneidade. A homogeneidade da preparação é um fator chave na obtenção de cristais que difratar de alta resolução (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Cristalização requer trazendo a macromolécula de supersaturação. A amostra deve ser concentrado para a concentração mais alta possível, sem causar agregação ou precipitação da macromolécula (geralmente 20-50 mg / mL). Introduzir a amostra para agente de precipitação pode promover a nucleação de cristais de proteínas na solução, que pode resultar em grandes tridimensional crescimento de cristais da solução. Existem duas técnicas principais para obter cristais: vapor de difusão e cristalização lote. Na difusão de vapor, uma gota contendo uma mistura de soluções precipitantes e de proteínas é selada em uma câmara com precipitante puro. O vapor de água, em seguida, difunde para fora da gota até a osmolaridade da queda e do precipitante são iguais (Figura 1A). A desidratação da gota provoca uma concentração de ambas as proteínas lenta e precipitante até que o equilíbrio é alcançado, de preferência na zona de nucleação de cristal do diagrama de fases. O método se baseia em lote trazendo a proteína diretamente para a zona de nucleação pela proteína mistura com a quantidade adequada de precipitante (Figura 1B). Este método é geralmente realizado sob uma parafina / mistura de óleo mineral para evitar a difusão de água para fora da gota.
Aqui vamos demonstrar dois tipos de configuração experimental para difusão de vapor, pendurado cair e cair sentado, além de cristalização lote sob óleo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo vamos descrever e demonstrar geral protocolos atuais para a cristalização de proteínas. Uma vez que um procedimento multi-passo, há algumas considerações a pessoa precisa estar ciente. Ao trabalhar com volumes muito pequenos (0,5-2 mL), secagem da gota devido à evaporação é uma grande preocupação. Assim, recomenda-se a trabalhar em um ambiente bem controlado (com baixo fluxo de ar, alta umidade e controle de temperatura apertado) e adotar uma técnica que minimiza a exposição da queda para o a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um Investigator Award Burroughs Wellcome para YM e por uma bolsa de pós-doutorado Brown-Coxe da Universidade de Yale para MD.
Materials
| New Item | ||||
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
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