Helcells-inspelning av Calcium Release-Aktivt Kalcium (CRAC) Strömmar i Human T-lymfocyter
Summary
Vi erbjuder en steg-för-steg-protokoll för hel-cell patch clamp inspelning av kalcium Release-Aktivt Kalcium (CRAC) strömmar i perifera mononukleära celler som härrör från mänskliga T-lymfocyter.
Abstract
I T-lymfocyter, utarmning av Ca 2 + från intracellulära Ca 2 + butiken leder till aktivering av plasmalemmal Ca 2 +-kanaler, som kallas Kalcium Release-Aktivt Kalcium (CRAC) kanaler. CRAC kanalerna spelar en viktig roll i regleringen av T celltillväxt och genuttryck. Onormal CRAC-kanalen fungerar i T-celler har kopplats till svår kombinerad immunbrist och autoimmuna sjukdomar 1, 2. Studera CRAC kanal funktion i mänskliga T-celler kan avslöja nya molekylära mekanismer som reglerar normala immunsvaret och reda ut orsaker relaterade mänskliga sjukdomar. Elektrofysiologiska inspelningar av membranet strömmar ge den mest exakta bedömningen av funktionella kanal egenskaper och deras reglering. Elektrofysiologiska bedömning av CRAC kanal strömmar i Jurkat T-celler, en människa leukemi T-cell linjen, uruppfördes mer än 20 år sedan 3 är dock fortfarande CRAC aktuella mätningar i normala mänskliga T-celler en utmanande uppgift. Svårigheterna att inspelningen CRAC kanal strömmar i normala T-celler förvärras av det faktum att blodbaserade T-lymfocyter är mycket mindre i storlek än Jurkat T-celler, och därmed den endogena helcells-CRAC strömmar är mycket låg i amplitud. Här ger vi en steg-för-steg förfarande som vi rutinmässigt använder för att spela in Ca 2 + eller Na + strömmar via CRAC kanaler i vilande mänskliga T-celler som isolerats från perifert blod hos friska frivilliga. Den metod som beskrivs här antogs av de förfaranden som används för att registrera CRAC strömmarna i Jurkat T-celler och aktiverade mänskliga T-celler 4-8.
Protocol
Discussion
Den elektrofysiologiska undersökning av CRAC strömningar i vilande mänskliga T-celler är en utmanande uppgift, eftersom den endogena CRAC strömamplituden i dessa celler är liten på grund av småcellig storlek (vilande mänskliga T-cell diameter är i storleksordningen 5-8 mikrometer). Här presenterar vi en steg-för-steg-förfarande för att tillförlitligt spela CRAC strömmar i vilande humana T-lymfocyter som isolerats från perifert blod mononukleära celler. Denna teknologi tillåter oss att undersöka fysio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma till Institutionen för fysiologi och Membrane Biology, University of California Davis för att förse oss med resurser och en utmärkt miljö för studier av jonkanaler.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada | 15061 | ||
| RosetteSep Density Medium | StemCell Technologies | 15705 | ||
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher, Waltham, MA | SH3025501 | ||
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific, Tarzana, CA | FB-01 | ||
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 35050 | ||
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | ||
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | ||
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | ||
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | ||
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | ||
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | ||
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | ||
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | ||
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning, Midland, MI | 3097358-1004 | ||
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning, Midland, MI | |||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA | 63-540 | ||
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments, Bellmore, NY | |||
| Micromanipulator | Sutter Instrument, Novato, CA | MP-285 | ||
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus America, Center Valley, PA | 1X71 | ||
| Windows Computer | Dell | |||
| Pulse software | HEKA Instruments | |||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab, Northampton, MA | |||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument | BF150-110-7.5 | ||
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Los Angeles, CA | MF-830 | ||
| Silicon O-rings | McMASTER-CARR, Santa Fe Springs, CA | 111 S70 | ||
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
References
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, . Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
