监测免疫细胞在腹腔感染数小时后对荧光标记朊病毒纤维的迁移作用

摘要

本文介绍了一种新方法，用于监测免疫细胞在腹腔接种后立即摄取和转运朊病毒的过程。该方法通过纯化来自感染脑组织的聚集性朊病毒纤维，并用荧光标记，随后追踪其从注射部位的摄取与移动情况，并鉴定介导这些过程的细胞类型。

摘要

存在一种异常构象的宿主编码型朊蛋白（PrPC），其具有抗蛋白酶特性，并表现出病理性和传染性，这是朊蛋白病的特征，例如鹿科动物的慢性消耗性疾病（CWD）和羊的瘙痒病。朊病毒假说认为，这种异常构象体构成了传染性朊病毒的大部分或全部成分。免疫系统在CWD和瘙痒病外周朊病毒致病早期事件中的作用已得到充分证实 ^1-3转基因和药理学小鼠研究表明，补体系统在感染早期维持和复制朊病毒方面具有重要作用 ^4-6. 体外 和 体内 研究还观察到树突状细胞对朊病毒的滞留作用 ^7-10，尽管它们在运输中的作用尚不明确 ^11-16巨噬细胞同样被认为参与了朊病毒病的早期发病机制，但这些研究主要关注感染后数周内发生的时间过程 ^3,11,17这些先前的研究还存在难以区分内源性PrP的问题^C 以及具有感染性的朊病毒。本文描述了一种半定量且无偏倚的方法，用于评估募集至接种部位的免疫细胞对朊病毒的摄取及其转运过程。聚集态的朊病毒棒状结构通过去垢剂溶解感染脑组织匀浆中的非聚集蛋白，并经蔗糖垫超速离心进行纯化。聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色及蛋白质印迹分析证实，沉淀组分中富含高度纯化的朊病毒棒状结构。将荧光染料标记的朊病毒棒状结构经腹腔注射入小鼠体内，2小时后收集腹腔灌洗液、脾脏以及纵隔和肠系膜淋巴结中的免疫细胞，利用针对单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞以及B细胞和T细胞的多色流式细胞术标记物，检测各细胞亚群对朊病毒棒状结构的滞留情况。该检测方法首次实现了对获取并转运朊病毒的免疫细胞进行直接监测。 体内 感染后数小时内即可检测。该检测方法还能明确区分具有感染性的聚集态朙蛋白与宿主细胞正常表达的PrPC，而在其他检测系统中，二者的区分往往较为困难，易导致数据解读问题。本方案还可适用于其他接种途径（如口服、静脉注射、神经内注射和皮下注射）以及多种抗原（如偶联微珠、细菌、病毒和寄生虫病原体及蛋白质、卵蛋白等）。

方案

1. 朊病毒纤维的纯化与标记

本方案改编自先前已发表的一项研究¹⁸

1. 将100克朊病毒感染的脑组织在900 mL冰浴匀浆缓冲液（HB，含320 mM蔗糖、150 mM NaCl和4 mM EDTA的1×PBS）中，使用商用匀浆器以最大速度匀浆1分钟，然后在冰上静置2分钟。重复此步骤三次。
2. 将匀浆液在3000 × g、4°C条件下离心10分钟。移去上清液并置于冰上保存。将沉淀物重悬于1 L HB中，并重复步骤1.1和1.2。
3. 合并所有上清液，在100,000 × g、0°C条件下离心60分钟。弃去上清液。
4. 将沉淀物重悬于100 mL含2% Triton X-100的1×Tris缓冲盐水（TBST，10 mM Tris-HCl、0.1 mM NaCl和1 mM EDTA）中。通过Bradford法或类似方法测定蛋白浓度，并用TBST调节至5 mg/mL。在冰上冷却30分钟。
5. 在100,000 × g、0°C条件下离心30分钟。弃去上清液，依次用50 mL TBST和100 mL TBS洗涤沉淀物。将沉淀物重悬于100 mL含1% Sarkosyl和蛋白酶抑制剂混合物的1×PBS中，在37°C下搅拌120分钟。
6. 将样品铺在900 mL 320 mM蔗糖溶液上，在100,000 × g、10°C条件下离心60分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于10 m....

讨论

此处我们展示了一种用于标记和追踪朊病毒的实验方案 体内 这极大地促进了对外周朊病毒早期感染事件的监测。该方案显著改进了以往对朊病毒摄取监测的尝试。 体外 ⁹ 和 体内 ^3,12 通过预先标记高度富集的朊病毒接种物，以明确区分其与内源性PrP^C. 由于具有感染性的朊病毒和PrP^C 共享相同的初级氨基酸序列，因此制备针对朊病毒的特异性抗体一直存在困难。我们曾使用蛋白酶K消化并经甲醇沉淀的粗制脑组织匀浆，注射至PrP基因敲除小鼠体内，并用Dylight 649标记的抗-PrP抗体进行追踪（未发表数据）。这些实验获得的结果与本研究展示的结果几乎一致，但PrP基因敲除小鼠无法商业获取，且对朊病毒疾病不具易感性 ¹⁹ 且缺乏目前已知的唯一真正的朊病毒受体PrP^C该方案允许使用表达内源性PrP的常见实验小鼠品系^C，避免了使用PrP基因敲除小鼠可能带来的问题。

此处显示的数据表明，免疫细胞对.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
慢性消耗性疾病感染的麋鹿脑	科罗拉多州私人麋鹿养殖场		使用任何非人类朊病毒感染名脑组织
搅拌器	Oster 专业产品	6694-015	使用任何市售搅拌机
离心	Sorvall，赛默飞世尔科技	SS34 转子	使用任何可达到 3000 x g 且能容纳 ≥ 500 ml 体积
超速离心机	贝克曼库尔特公司	50.2 Ti 转子	使用任何可达到 100,000 x g 并能容纳 ≥ 500 ml 体积
Bradford 试剂	Sigma-Aldrich	B6916
完全迷你蛋白酶抑制剂混合物	罗氏集团	11 836 170 001
超声波破碎仪	Misonix	MP4000X	使用任何设定为最大功率约70%的探头超声仪或喇叭超声仪
DyLight 抗体标记试剂盒	赛默飞世尔科技公司	53050
微型离心机	Eppendorf	55430R	使用任何可达到13,000x的制冷微量离心机 g
离心过滤柱	EMD Millipore	Microcon YM-100	使用截留分子量为100 Kd的滤膜或透析膜
8-40周龄的FVB小鼠	查尔斯河实验室	207	使用任何近交系小鼠品系
1 μm 红色荧光微球	Phosphorex	2307	使用任意荧光微球 ≤ 10 μm
RPMI 1640 培养基	Invitrogen	11875-093
40 μm细胞滤器	Falcon BD	352340
荧光抗体	BD生物科学	各种	使用适合您实验应用的任何荧光抗体。
流式细胞仪	Dako	CyanADP	使用任何能够进行多色荧光检测的流式细胞仪