Surveillance des cellules immunitaires trafic fluorescent Rods Prion heures après l'infection par voie intrapéritonéale

Summary

Nous décrivons ici un nouveau test pour la surveillance et le trafic de l'absorption du prion par les cellules immunitaires, immédiatement après l'inoculation intrapéritonéale en purifiant et en fluorescence étiquetage tiges prion agrégés à partir de tissu cérébral infecté, puis le suivi de leur absorption et le mouvement à partir du site d'injection et la caractérisation des cellules médiation de ces événements.

Abstract

Présence d'une forme anormale d'une protéine prion codée par l'hôte (PrPc) qui est résistant à la protéase, pathologiques et infectieux caractérise les maladies à prions comme la maladie débilitante chronique (MDC) des cervidés et la tremblante du mouton. L'hypothèse du prion, affirme que ce conformère anormal constitue plupart ou la totalité du prion infectieux. Le rôle du système immunitaire dans les événements précoces dans la pathogenèse du prion périphérique a été démontré de façon convaincante pour le MDC et la tremblante ^1-3. Des études pharmacologiques transgéniques et des souris ont révélé un rôle important du système du complément à conserver et reproduire les prions tôt après l'infection ^4-6. In vitro et in vivo ont également observé la rétention des prions par les cellules dendritiques ^7-10, bien que leur rôle dans le trafic reste clair ^11-16. Les macrophages ont eux aussi été impliqués dans la pathogenèse du prion début, mais ces études ont porté sur les événements survenus semaines après l'infection ^3,11,17. Ces études antérieures souffrent également du problème de la différenciation entre endogènes PrP ^C et les prions infectieux. Nous décrivons ici un semi-quantitative, approche impartiale pour évaluer l'absorption du prion et le trafic du site d'inoculation par les cellules immunitaires recrutées là. Tringles à prions ont été agrégées purifiée à partir de l'homogénat de cerveau infecté par solubilisation d'un détergent non agrégées de protéines et d'ultracentrifugation sur un coussin de saccharose. Électrophorèse sur gel polyacrylamide, le bleu de Coomassie coloration et l'ouest de la récupération buvard confirmés de tiges prion hautement enrichi dans la fraction culot. Tringles à prions ont été marqués par voie intrapéritonéale fluorochrome, puis injectées dans des souris. Deux heures plus tard les cellules immunitaires du liquide de lavage péritonéal, la rate et les ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques ont été analysés pour la rétention des prions tige et sous-ensembles de cellules identifiées par cytométrie en flux utilisant des marqueurs multicolores pour les monocytes, les neutrophiles, les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules B et T. Ce test permet la surveillance directe de la première fois des cellules immunitaires acquisition et prions le trafic in vivo dans les heures suivant l'infection. Ce test a également différencie clairement infectieuses, les prions agrégés à partir de la PrPC normalement exprimé sur les cellules hôtes, ce qui peut être difficile et conduire à des problèmes d'interprétation des données dans les systèmes de dosage d'autres. Ce protocole peut être adapté à d'autres voies d'inoculation (voie orale, intraveineuse, intranervous et sous-cutanée, par exemple) et les antigènes (perles conjugués, les agents pathogènes bactériens, viraux et parasitaires et les protéines, les œufs) ainsi.

Protocol

1. Purifiant et l'étiquetage des tiges à prions Ce protocole est adapté d'un 18 précédemment publiés Homogénéiser 100 grammes de prion infectées par le tissu cérébral dans 900 ml de glace de tampon d'homogénéisation froid (HB, 1X PBS contenant 320 mM de saccharose, NaCl 150 mM EDTA et 4mm) 1 min à vitesse maximale dans une publicité mixeur, puis 2 min sur la glace. Répétez trois fois. Centrifuger l'homogénat pendant 10 m…

Discussion

Ici nous démontrons un protocole de marquage et de suivi des prions in vivo qui facilite grandement le suivi des événements précoces de l'infection à prion périphériques. Ce protocole améliore grandement sur ​​les tentatives passées au absorption prion surveillance in vitro et in vivo ^{9 3,12} en pré-étiquetage inoculum prion hautement enrichi sans ambiguïté le différencier de la PrP ^C endogène. Parce que les prions infectieux et la PrP ^C p…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
CWD-infected elk brain		Private elk farm in Colorado		Use any non-human prion-infected brain
Blender		Oster	6694-015	Use any commercial blender
Centrifuge		Sorvall	SS34 rotor	Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Ultracentrifuge		Beckman	50.2 Ti rotor	Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Bradford Reagent		Sigma-Aldrich	B6916
Complete mini protease inhibitor cocktail		Roche	11 836 170 001
Sonicator		Misonix	MP4000X	Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power
DyLight antibody Labeling kit		Thermo Scientific	53050
microcentrifuge		Eppendorf	55430R	Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g
centrifugal filter columns		Millipore	Microcon YM-100	Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff
8-40 week-old FVB mice		Charles River	207	Use any inbred mouse strain
1 μm red fluorescent beads		Phosphorex	2307	Use any fluorescent bead ≤ 10 μm
RPMI 1640 medium		Invitrogen	11875-093
40 μm cell strainer		Falcon	352340
fluorescent antibodies		BD pharmingen	Various	Use any fluorescent antibody appropriate for your application.
flow cytometer		Dakocytomation	CyanADP	Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection